靶向抗腫瘤耦聯(lián)物苯丙胺酸氮芥—己二酸橋—偕二磷酸的靶向性及療效實驗研究.pdf

1、目的：本研究的目的在于開發(fā)一種新型的靶向抗腫瘤藥物，將親骨性載體二膦酸鹽與化療藥物苯丙胺酸氮芥耦聯(lián)，并將放射性核素<'153>Sm與耦連物鰲合，合成一種雙膦酸鹽和親骨核素為導(dǎo)向、化療藥物和B射線協(xié)同發(fā)揮作用的骨腫瘤靶向治療系統(tǒng)，特異性識別、殺滅惡性骨腫瘤細胞，全身其它非靶向臟器藥物濃度低，毒副作用小，達到高效低毒治療骨腫瘤的目的。并通過體內(nèi)體外實驗驗證合成耦聯(lián)物的生物效應(yīng)，為以后的臨床試驗用藥提供理論依據(jù)。 方法： (1

2、)耦連物的合成及鑒定：將苯丙胺酸氮芥與二膦酸鹽耦聯(lián)，<'153>Sm與耦聯(lián)物鰲合，合成新的耦聯(lián)物，采用核磁共振儀、紅外光譜儀、質(zhì)譜分析，確定其組分、相對含量及結(jié)構(gòu)鑒定；羥基磷灰石晶體吸附實驗和荷瘤鼠體內(nèi)分布顯像實驗，了解耦聯(lián)物體內(nèi)外的親骨性能。 (2)耦聯(lián)物的細胞毒性實驗：①體外培養(yǎng)觀察不同濃度的耦連物對成骨細胞的影響；②采用MTT、細胞活力分析、丫啶橙染色、流式細胞術(shù)、掃描電鏡，觀察不同濃度的耦連物對MG-63細胞增殖和凋亡的

3、影響。 (3)裸鼠體內(nèi)耦連物抗腫瘤實驗研究：①用γ免疫計數(shù)儀、高效液相色譜儀分析測定靶組織(骨、腫瘤)和非靶組織(心、肝、腎)藥物濃度，研究偶聯(lián)物在小鼠體內(nèi)的動力學(xué)分布規(guī)律和骨靶向性；②不同濃度耦連物對腫瘤的影響，計算抑瘤率；③RT-PCR和Western blot法，檢測實驗組和對照組caspase-3基因、C-myc基因表達差異。 結(jié)果： (1)耦連物的合成及鑒定：對合成的耦聯(lián)物結(jié)構(gòu)進行核磁共振波譜分析，得出

4、的光譜數(shù)據(jù)符合藥物合成的要求；耦聯(lián)物在體外對羥基磷灰石具有良好的吸附性能，在體內(nèi)骨骼系統(tǒng)和血流豐富的臟器，尤其是腫瘤部位高度濃聚。 (2)耦聯(lián)物的細胞毒性實驗：①不同濃度的耦聯(lián)物對成骨細胞的貼壁率、體外克隆形成及細胞活力無明顯影響， MTT實驗顯示耦聯(lián)物各濃度組的成骨細胞OD值逐日增高，各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。②MG-63骨肉瘤細胞MTT實驗顯示：不同濃度的耦聯(lián)物及苯丙胺酸氮芥作用下的骨肉瘤細胞，經(jīng)過24到96小時

5、培養(yǎng)后，OD值均減小，其中2000ug/ml濃度的耦聯(lián)物組及陽性對照組在同一時間有顯著性差異(P<0.05)。細胞活力分析顯示活細胞比例明顯降低。24小時內(nèi)各時間點各濃度組細胞活力無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；24小時，400ug/ml、2000ug/ml組與陽性對照組間有顯著性差異(P<0.05)；48小時，4ug/ml、400ug/ml、2000ug/ml組與陽性對照組間有顯著性差異(P<0.05)。丫啶橙染色結(jié)果：隨著藥物濃度提高

6、和作用時間延長，可見凋亡小體形成。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：耦聯(lián)物濃度為40ug/ml，苯丙胺酸氮芥濃度20ug/ml作用過的MG--63骨肉瘤細胞從24到96小時，凋亡率逐漸增高。電鏡觀察結(jié)果：對照組可見骨肉瘤細胞核完整規(guī)則，實驗組隨作用藥物濃度及作用時間增加，出現(xiàn)典型的凋亡細胞。 (3)裸鼠體內(nèi)耦連物抗腫瘤實驗研究：①小鼠體內(nèi)放射性計數(shù)分布顯示骨組織中的強度遠遠高于其它臟器，在3小時左右藥物在骨組織中的濃度達到峰值。荷瘤裸鼠各個臟

7、器中放射性計數(shù)在腫瘤組織中最高，其次為骨組織，再次為性腺、脾、肺等臟器。②經(jīng)耦聯(lián)物及苯丙胺酸氮芥作用后，裸鼠腫瘤生長明顯受抑制，實驗組高中劑量組與對照組間瘤重有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。實驗組與陽性對照組的抑瘤率分別是37.85％、32.02％、16.16％和17.11％。高、中劑量組腫瘤抑制率均大于30％。大體觀察發(fā)現(xiàn)耦聯(lián)物處理組的裸鼠飲食及精神等狀況均優(yōu)于苯丙胺酸氮芥處理組。③耦連物組腫瘤組織中Caspase-3的表達明顯高于對照

8、組(P<0.05)：用藥組C-myc癌基因的mRNA較對照組下降了3.26倍。 結(jié)論： 1.新合成的耦聯(lián)物符合原藥的功能結(jié)構(gòu)特征；羥基磷灰石體外吸附試驗、核素153Sin標記耦聯(lián)物荷瘤鼠體內(nèi)分布顯像實驗確定該耦聯(lián)物具有骨靶向性，并且耦連物對骨腫瘤區(qū)域有較好的親和性。 2.耦聯(lián)物對成骨細胞無明顯的毒性作用；耦聯(lián)物對骨肉瘤MG-63細胞有較強的誘導(dǎo)凋亡作用，隨著耦聯(lián)物濃度的升高及作用時間的延長MG-63細胞的凋亡率逐