樹枝狀酞菁硅—聚合物納米粒子對實驗性脈絡膜新生血管的光動力效應.pdf

1、多種病因引起的脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）是導致患者中心視力喪失的重要原因之一。治療CNV及相關疾病是目前眼科學研究領域的研究熱點，很多學者都致力于尋找有效的治療方法。目前主要的治療方法包括：光動力學療法（photodynamic therapy,PDT）,傳統(tǒng)激光療法，經(jīng)瞳孔溫熱療法,手術療法，放射療法，藥物治療及吲哚青綠介導的光栓療法等。PDT由于選擇性高、對周圍組織損傷小、不

2、損傷視力，較其它方法安全、有效，是目前較成熟的治療CNV的方法。
　　光敏劑是PDT的核心物質，新型光敏劑的研究一直是PDT的研究重點之一。PDT的提出、發(fā)展及應用都是隨著光敏劑的發(fā)展而逐漸完善的。具有親水性-親脂性結構的酞菁類配合物是很有應用前景的靶向型光敏劑。負載硝基芳基芐醚樹枝配體軸向取代硅(IV)酞菁聚合物納米粒子（SiPc-n）是一種新型的國產光敏劑，引入的樹枝狀軸向取代基團能有效抑制酞菁聚集，有利于提高光敏活性，應用聚

3、乙二醇單甲醚-乳酸-羥基乙酸共聚物（mPEG-PLGA）雙親性納米粒對硅(IV)酞菁聚合物進行包裹，有效改善水溶性。
　　本研究通過觀察SiPc-n介導的PDT對臍靜脈內皮細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞的影響，以及對BN大鼠CNV的作用，評價SiPc-n治療CNV的可行性和有效性，初步闡明作用機制，為SiPc-n的開發(fā)應用提供實驗依據(jù)和理論基礎。本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 SiPc-n PDT對正常臍靜脈內皮細胞

4、（HUVEC）和視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）的影響
　　目的：觀察SiPc-n PDT后體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）增殖和凋亡的變化，探討SiPc-n PDT引起細胞死亡可能的機制及對細胞功能的影響。
　　方法：1.測定HUVEC和RPE內SiPc-n含量變化：HUVEC和RPE分別與含終濃度20ug/ml SiPc-n的培養(yǎng)液共孵育。間隔數(shù)小時收集一組細胞，洗滌、計數(shù)和超聲破裂細

5、胞，制備細胞裂解產物上清，應用熒光分光光度計檢測并計算SiPc-n的含量，以此推斷SiPc-n分別在HUVEC和RPE中的攝取和代謝變化規(guī)律。
　　2.SiPc-n PDT對HUVEC和RPE細胞增殖的影響：細胞分為PDT組、光敏劑組、激光組和空白組，分別加入5-20μg/ml SiPc-n，應用2-20J/cm2半導體激光照射，CCK-8比色法、臺盼蘭拒染法觀察SiPc-n PDT對HUVEC和RPE增殖的影響。
　　3.

6、SiPc-n PDT引起細胞死亡形式的檢測：Hoechst33342染色法和透射電鏡觀察PDT前后細胞的形態(tài)學變化，激光共聚焦檢測線粒體膜電位的變化，應用流式細胞儀檢測細胞內活性氧產生的變化、結合Annexin V-PI雙染法判斷細胞死亡的形式。
　　4.SiPc-n PDT對HUVEC和RPE功能影響的分析：熒光定量PCR檢測SiPc-n PDT前后HUVEC和RPE細胞VEGFmRNA和PEDFmRNA表達的變化。
　　

7、結果：1.HUVEC及RPE細胞內的SiPc-n濃度變化存在差異：與SiPc-n共孵育時，HUVEC10h內SiPc-n含量達到峰值，RPE5h達高峰。SiPc-n比SiPc達峰時間提前，攝取量提高。
　　2.SiPc-n可抑制HUVEC和RPE的增殖：SiPc-n-PDT可抑制HUVEC和RPE細胞增殖，抑制作用呈劑量-效應關系，在20μg/mlSiPc-n和10 J/cm2激光能量時活細胞數(shù)明顯減少。
　　3.SiPc-

8、n可誘導HUVEC和RPE發(fā)生線粒體相關的細胞凋亡：Hoechst33342染色和透射電鏡可見HUVEC和RPE細胞經(jīng)SiPc-n PDT后，細胞形態(tài)出現(xiàn)凋亡的改變，隨著時間延長，凋亡細胞逐漸增多；激光共聚焦檢測SiPc-n PDT組的線粒體膜電位較對照組明顯下降，差別達統(tǒng)計學意義；流式細胞儀檢測SiPc-n PDT組較對照組活性氧產生增多，差別達統(tǒng)計學意義。流式細胞儀檢測結合Annexin V-PI雙染法顯示SiPc-n PDT組細胞

9、死亡以凋亡為主，且HUVEC細胞組凋亡數(shù)多于RPE細胞組。
　　4.SiPc-n PDT可引起VEGFmRNA和PEDFmRNA表達量發(fā)生改變，平衡失調。
　　結論：SiPc-n在特定波長激光的激發(fā)下可表現(xiàn)良好的光動力活性。SiPc-n PDT時可明顯抑制HUVEC和RPE細胞增殖；SiPc-n-PDT主要誘導HUVEC和RPE細胞發(fā)生凋亡并導致血管生成相關基因表達改變。聚合物納米載體可提高藥物的靶向性和攝取率。
　　

10、第二部分 激光誘導BN大鼠CNV模型的建立和評估
　　目的：觀察倍頻532nm激光誘導BN大鼠CNV模型的成模時間和變化規(guī)律，探討適宜PDT治療的時間點。
　　方法：25只健康BN大鼠行倍頻532nm激光眼底光凝，等分為5組，4只健康BN大鼠做為正常對照組，激光功率140 mw，光斑直徑50μm，曝光時間100ms。分別于7d、14d、21d、28d、56d光凝后行熒光血管照影（FFA）、吲哚菁綠血管照影（ICGA）、眼底光

11、學相干斷層掃描（OCT）檢查、光鏡觀察、免疫組織化學檢查。
　　結果：光凝后14d開始出現(xiàn)CNV，28d達高峰，成模率84％，F(xiàn)FA示典型圓盤狀滲漏，ICGA可見CNV充盈，OCT、組織學檢查均可見CNV形成。
　　結論：倍頻532nm激光光凝可成功誘導BN大鼠CNV模型，成模率高，成模時間短，持續(xù)時間長。21-28d可做為PDT治療的時間點。
　　第三部分 SiPc-n介導的光動力學療法治療BN大鼠脈絡膜新生血管

12、r>　　目的：觀察不同劑量SiPc-n PDT對BN大鼠CNV的影響，探討SiPc-n PDT治療CNV的可行性。
　　方法：光凝后28d，取有典型的CNV的大鼠21只，分為SiPc-n介導的PDT1組(注射3mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射83s)、2組：SiPc-n介導的PDT2組(注射6mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射83s)、3組：SiPc-n介導的 PDT3組(注射3mg/m2SiPc

13、-n+600mW/cm2激光照射166s)、4組：SiPc-n介導的 PDT4組(注射6mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射166s)、5組：維替泊芬介導的PDT組（注射6mg/m2維替泊芬+激光照射83s）、6組：應用SiPc-n后不打激光組（注射6mg/m2SiPc-n）、7組：空白對照組。尾靜脈注射光敏劑后20min后開始激光照射，所用參數(shù)：光斑直徑2400μm，激光能量密度：50J/cm2，輸出功率：600 mW/

14、cm2，光照時間83s或166s。治療后7d行眼底鏡、FFA檢查、OCT、光鏡、免疫組化和電鏡檢查。
　　結果：FFA顯示各治療參數(shù)的CNV閉合程度不同，隨能量的增加和光敏劑劑量的增加而提高。光凝后1d，PDT組視網(wǎng)膜水腫，各組CNV熒光滲漏無改變；光凝后7d，維替泊芬組、注射6mg/m2SiPc-n+600mW/cm2激光照射166s組滲漏停止率高于其它組別，其余組CNV滲漏均無改變。
　　結論：選擇適當參數(shù)SiPc-n