唑來膦酸治療乳腺癌的新機(jī)制-BKCa通道的調(diào)控作用.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性實(shí)體腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前，臨床上所采用的早期診斷、手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌以及分子靶向治療等綜合治療模式使得乳腺癌的死亡率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但其復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率仍然很高。唑來膦酸（zoledronicacids）是近年來發(fā)展起來的一類新藥物，其對乳腺癌骨性轉(zhuǎn)移的治療效果已經(jīng)在臨床實(shí)踐中獲得證實(shí)。最新的研究亦表明，唑來膦酸不但可以抑制破骨細(xì)胞的骨破壞與骨吸收，還可以直接作用于乳腺癌細(xì)胞

2、而發(fā)揮抗腫瘤作用，其機(jī)制涉及唑來膦酸誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡與自噬、抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、預(yù)防乳腺癌細(xì)胞對骨的侵襲與粘附以及降低乳腺癌組織的血管生成。但目前關(guān)于唑來膦酸發(fā)揮抗腫瘤作用的分子靶點(diǎn)與信號通路還不清楚，有待更深入的研究。
　　無論是心肌或平滑肌等可興奮細(xì)胞，還是腫瘤細(xì)胞等非興奮性細(xì)胞，其細(xì)胞膜表面都有大量離子通道的表達(dá)。離子通道的主要作用是調(diào)控細(xì)胞膜內(nèi)外K+、Ca2+、Na+與Cl-等離子的穩(wěn)態(tài)平衡，因而對細(xì)胞的病理與生理過

3、程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（Bigconductancecalcium-activatedK+channel,BKCa）在許多細(xì)胞膜上均有高度表達(dá)，其可受細(xì)胞膜電位與細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+的雙重調(diào)控。心血管系統(tǒng)中的BKCa通道對血管的收縮-舒張起著重要的調(diào)控作用，而且最新的研究證實(shí)BKCa通道的激活可顯著誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascularsmoothmusclecell,VSMCs）的凋亡。近年的研究亦表明，人乳腺癌細(xì)胞膜上的

4、BKCa通道也高度表達(dá)，并且BKCa通道的異?？赡芘c雌激素受體（estrogenreceptor,ER）、人表皮生長因子受體2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER-2）等經(jīng)典腫瘤分子標(biāo)志物高度相關(guān)，因而推測BKCa通道也可能參與了乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展過程，但其發(fā)揮了何種作用還不清楚。我們在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與MCF-7的BKCa通道電流，那么是否如V

5、SMCs一樣，唑來膦酸是否可通過激活BKCa通道誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞凋亡？并且唑來膦酸所引起的BKCa通道激活是否也調(diào)控了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲與血管形成等過程？
　　為了驗(yàn)證以上的假說，我們分別在體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系與裸鼠種植瘤2個(gè)水平進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。我們選擇了ER陰性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系、ER陽性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染了BKCa通道α亞基基因(hSloα)的人胚胎腎細(xì)胞293（humanembryonic

6、kidney293,HEK293），利用全細(xì)胞與單通道膜片鉗技術(shù)記錄唑來膦酸對BKCa通道電流的影響；通過免疫細(xì)胞化學(xué)、DNA片段瓊脂糖凝膠電泳分析與流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，并檢測了MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)Ca2+與線粒體膜電位(Δψm)的變化以探討凋亡可能的機(jī)制；以MTT與細(xì)胞增殖核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）免疫組化染色來檢測MDA-MB-231細(xì)胞的增殖；以劃痕實(shí)驗(yàn)與trans

7、well小室檢測MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力；以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）的體外成環(huán)實(shí)驗(yàn)以及雞胚尿膜囊（chickenembryoallantoidsmembrane,CAM）來檢測血管的形成能力。最后，我們建立了MDA-MB-231細(xì)胞的裸鼠種植瘤模型，觀察了BKCa通道抑制劑（Iberiotoxin,IBTX）在唑來膦酸治療乳腺癌組織中的作用。我

8、們的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1、唑來膦酸通過激活BKCa通道誘導(dǎo)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的凋亡：
　　通過膜片鉗技術(shù)我們證實(shí)MDA-MB-231與MCF-7乳腺癌細(xì)胞系上均有BKCa通道的存在。對MDA-MB-231細(xì)胞而言，唑來膦酸可顯著增加BKCa通道的活性，而激活的BKCa通道可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，其機(jī)制涉及胞內(nèi)Ca2+濃度的升高與線粒體膜電位(Δψm)的去極化。我們還把BKCa通道α亞基轉(zhuǎn)染到HE

9、K293細(xì)胞上，證實(shí)唑來膦酸激活BKCa通道的作用靶點(diǎn)就在α亞基上。對MCF-7而言，唑來膦酸也可激活MCF-7細(xì)胞的BKCa通道，但BKCa通道的激活卻不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如果以ER拮抗劑ICI182780阻斷MCF-7細(xì)胞ER的功能，則唑來膦酸則可通過激活BKCa通道誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，因此，我們推測ER的存在可能干擾了BKCa通道的作用。
　　2、唑來膦酸通過激活BKCa通道抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲以及血管

10、生成：
　　由于MCF-7細(xì)胞膜上BKCa通道不參與凋亡的調(diào)控，因此我們的研究重點(diǎn)集中在MDA-MB-231細(xì)胞上。我們發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力，也可明顯降低HUVECs的體外成環(huán)與CAM的體內(nèi)血管生成，但BKCa通道阻斷劑IBTX或TEA則可部分逆轉(zhuǎn)唑來膦酸的這種作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明唑來膦酸激活的BKCa通道不但可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，還可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞的

11、增殖、侵襲、以及血管的形成。
　　3、唑來膦酸通過調(diào)控BKCa通道抑制MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長：
　　我們觀察到注射唑來膦酸可抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞種植瘤的生長，且種植瘤組織的凋亡相關(guān)基因caspase-3、粘附相關(guān)基因E-cadherin與血管生成促進(jìn)因子-血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）均發(fā)生顯著改變，而BKCa通道阻斷劑IBTX