培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌體內外抗腫瘤作用及相關機制的研究.pdf

1、研究目的:研究培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌的體內外抗腫瘤作用效果及用藥安全性;明確Mina53基因在三陰性乳腺癌中的表達情況及對其三陰性乳腺癌生物學行為的影響;探討培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌的協(xié)同抗腫瘤作用機制。
　　研究方法:1）CellTiter96(@)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay法檢測培美曲塞、唑來膦酸對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-2

2、31-fLuc-GFP的生長抑制作用及篩選實驗最適濃度，驗證培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的生長是否有協(xié)同抑制作用;流式細胞儀碘化丙啶(PI)染色法及AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLue-GFP的細胞周期及細胞凋亡的影響;Realtime-PCR方法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌細胞MD

3、A-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2、VEGF、Bax、Bcl-2基因的mRNA表達的影響。2）在裸鼠皮下建立三陰性乳腺癌異種移植瘤動物模型;通過用游標卡尺測量計算腫瘤體積的變化趨勢，用小動物活體成像儀采集腫瘤自發(fā)熒光信號變化趨勢來比較培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌的體內抗腫瘤作用效果;通過觀察裸鼠的行為、活動及體重的變化來評估用藥的安全性;用免疫組化檢測法觀察培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應用對

4、腫瘤組織中CD31、CD11b的蛋白表達的影響。3）Real time-PCR方法檢測三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231-fLuc-GFP、Luminal型乳腺癌細胞系MCF-7、HER-2過表達型乳腺癌細胞系SK-BR-3及人類正常乳腺上皮細胞系MCF-10A中Mina53基因的mRNA表達情況;Western bolt方法檢測MDA-MB-231-fLuc-GFP、MCF-7、SK-BR-3及MCF-10A細胞系中Mina53蛋

5、白表達情況;利用RNA干擾技術siRNA-Mina53轉染MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞，抑制其中Mina53基因的表達;用Real time-PCR方法檢測siRNA-Mina53的轉染效率同時篩選siRNA-Mina53對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53基因表達的抑制的最佳轉染濃度;Western bolt方法檢測siRNA-Mina53的轉染效率同時篩選siRNA-Mina53對三陰

6、性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53蛋白表達抑制的最佳轉染濃度;CellTiter96(@)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay法檢測Mina53基因表達沉默對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP增殖的影響;流式細胞儀碘化丙啶(PI)染色及AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測Mina53基因表達沉默對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-2

7、31-fLuc-GFP細胞周期及細胞凋亡的影響;Transwell實驗檢測Mina53基因表達沉默對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞遷移、侵襲能力的影響;細胞粘附實驗檢測Mina53基因表達沉默對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞粘附能力的影響;Real time-PCR方法檢測Mina53基因表達沉默對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2、

8、VEGF、Bax、Bcl-2基因mRNA表達量的影響。4) Real time-PCR方法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53基因mRNA表達量的影響;Western bolt方法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53蛋白表達量的影響;免疫組化法檢測培美曲塞、唑來膦酸及二者應用對三陰性乳腺癌組織中Mi

9、na53的蛋白表達的影響。
　　研究結果:1）培美曲塞與唑來膦酸對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的生長均有抑制作用，而且抑制作用具有濃度依賴性，隨著藥物濃度的升高而增強;體外實驗中培美曲塞對MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞的最造抑制濃度為10μmol/L，唑來膦酸對MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞的最適抑制濃度為100μmol/L，培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組細胞活度較單獨用藥組明顯降低(P＜

10、0.05)，且二者聯(lián)合用藥指數(shù)CI=0.325＜1，說明培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的增殖具有協(xié)同抑制作用;與對照組相比，培美曲塞、唑來膦酸、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸均可使處于細胞周期亞G0/G1期與G0/G1期的MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞比例增加，但培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸應用使阻滯于G1期之前的細胞所占比例顯著高于單獨用藥所占的比例(P＜0.001)，同時聯(lián)合用藥組細胞增殖指數(shù)

11、PI=0.51889，明顯低于對照組及單獨用藥組;與對照組相比，培美曲塞組、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組細胞總凋亡率均顯著增高(P＜0.01，P＜0.001)，而唑來膦酸組細胞總凋亡率無明顯增高(P＞0.05),但培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的總凋亡率高于培美曲塞組(P＜0.05);培美曲塞、唑來膦酸、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸均可使三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2及VEGF基因的mRNA表達量降低，且聯(lián)

12、合用藥組的表達量低于單獨用藥組CyclinD1(P＜0.05)、MMP2(P＜0.01)及VEGF(P＜0.05)。與對照組相比，培美曲塞組(P＜0.05)、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組(P＜0.001)可以顯著提高Bax/Bcl-2比值，且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的升高水平顯著高于培美曲塞組(P＜0.001),但唑來膦酸組Bax/Bcl-2比值升高不明顯(P＞0.05)。2)體內實驗證實，至觀察終點，與對照組相比，無論是培美曲塞、唑來膦酸單獨

13、用藥還是二者聯(lián)合用藥均未對荷瘤裸鼠的行為、活動及體重產生明顯影響;培美曲塞、唑來膦酸及二者聯(lián)合用藥均可對三陰性乳腺癌腫瘤生長起到抑制作用，培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組對腫瘤體積的抑制率最高達到了86.942±3.695％，明顯高于培美曲塞組的53.238±5.513％和唑來膦酸組的31.506±6.359％，兩者之間比較差別均有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P＜0.001)，而且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的腫瘤體積抑制率高于相同劑量的培美曲塞

14、與唑來膦酸分別給藥組的腫瘤體積抑制率之和;至觀察終點時，培美曲塞組、唑來膦酸組及培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的腫瘤自發(fā)熒光信號強度均低于對照組(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)，且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組的腫瘤自發(fā)熒光信號強度也低于單獨用藥組(P＜0.05);實驗中各組腫瘤組織免疫組化結果顯示:培美曲塞、唑來膦酸均可抑制腫瘤組織中CD31蛋白的表達，二者聯(lián)合用藥后抑制作用更明顯;唑來膦酸對腫瘤組織中CD11b蛋白表達有明顯的抑制作用，

15、培美曲塞對其抑制作用不明顯，二者聯(lián)合用藥后抑制作用未見明顯增強。3）與正常乳腺上皮細胞相比，Mina53在乳腺癌各亞型細胞系中的表達量均顯著增高(P＜0.001)，且三陰性乳腺癌亞型細胞系MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53的表達量均顯著高于其它亞型乳腺癌細胞系(P＜0.001);siRNA-Mina53可有效轉染至MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞，抑制細胞中Mina53的表達，且空白對照組（正常 MDA-MB

16、-231-fLuc-GFP細胞）與陰性對照組（siRNA-control-MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞）細胞中Mina53的mRNA及蛋白的表達量均無明顯差別(P＞0.05)，經(jīng)過驗證，脂質體:siRNA-Mina53=1∶2比例配合的濃度為最適轉染濃度，對細胞中Mina53表達的抑制效率最高;與對照組相比，siRNA-Mina53轉染MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞靶向沉默Mina53基因表達后細胞增殖率自第4

17、8h開始顯著降低(P＜0.001)，被阻滯在亞G0/G1期與G0/G1期的細胞所占比例顯著增高(P＜0.001)，細胞總凋亡率顯著增高(P＜0.001)，同時，轉染后細胞的遷移、侵襲及粘附能力均顯著降低(P＜0.001);與對照組相比，siRNA-Mina53轉染MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞靶向沉默Mina53基因表達后的細胞中CyclinD1、MMP2及VEGF基因的mRNA表達量均顯著降低，(P＜0.0001)，但凋亡

18、相關基因Bax、Bcl-2的mRNA表達量的比值(Bax/Bcl-2反應細胞凋亡相關基因的表達水平)顯著增高(P＜0.001)。4)培美曲塞組、培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組處理的MDA-MB-231-fLuc-GFP細胞中Mina53基因的mRNA表達量均顯著低于對照組(P＜0.001，P＜0.001)，但在唑來膦酸組中降低不明顯(P＞0.05),而且培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸組中Mina53基因mRNA表達量顯著低于培美曲塞組(P＜0.001)，

19、在后續(xù)的不同藥物處理組細胞及腫瘤組織中Mina53蛋白表達水平的檢測中也得出了類似的結果。
　　研究結論:
　　1.體內外實驗結果均證實:培美曲塞與唑來膦酸聯(lián)合應用對三陰性乳腺癌具有協(xié)同抗腫瘤作用。且在一定的濃度范圍內培美曲塞與唑來膦酸聯(lián)合用藥是安全的，荷瘤裸鼠對培美曲塞與唑來膦酸聯(lián)合用藥的耐受性良好，無嚴重的副作用發(fā)生。
　　2.與正常乳腺上皮細胞相比，乳腺癌細胞中Mina53是高表達的。且Mina53在三陰性乳腺癌

20、細胞中的表達水平高于其他亞型的乳腺癌細胞。靶向沉默Mina53基因能顯著降低三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的增殖、遷移、侵襲及粘附能力，并對細胞中CyclinD1、MMP2、VEGF、Bax/Bcl-2的表達產生影響，提示Mina53有望成為作為三陰性乳腺癌的基因治療靶點。
　　3.培美曲塞聯(lián)合唑來膦酸對三陰性乳腺癌的協(xié)同抗腫瘤機制可能為:培美曲塞可以抑制三陰性乳腺癌中Mina53的表達，而Min53表達水

21、平的降低會引起三陰性乳腺癌中CyclinD1、MMP2、VEGF等表達水平的下調及凋亡相關基因Bax、Bcl-2的mRNA表達量的比值(Bax/Bcl-2反應細胞凋亡相關基因的表達水平)升高，從而降低三陰性乳腺癌中腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及粘附能力，誘導腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用;而唑來膦酸則是通過降低三陰性乳腺癌腫瘤細胞微環(huán)境中的CD11b陽性表達的M2型巨噬細胞的浸潤，進而降低由其分泌和釋放的MMP2和VEGF等因子的表達水