非諾貝特在三陰性乳腺癌中的抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:研究非諾貝特體內(nèi)、外抑制三陰性乳腺癌生長(zhǎng)的作用及其機(jī)制。
　　方法:采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8法（Cell count kit-8，CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)能力，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例和細(xì)胞周期分布比例，免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)通路蛋白水平，全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)差異表達(dá)的特征基因功能類和通路變化。MDA-MB-231移植瘤小鼠模型驗(yàn)證體內(nèi)抑制移植瘤生長(zhǎng)能力，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端

2、標(biāo)記法(Terminal deox-ytransferase-catalyzed DNA nick-end labeling，TUNEL)檢測(cè)瘤體組織切片中細(xì)胞凋亡的情況，裸鼠眼球采血，檢測(cè)血常規(guī)及肝腎功能指標(biāo)。
　　結(jié)果:1.非諾貝特能夠抑制乳腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)能力，其中對(duì)非諾貝特最為敏感的前五個(gè)細(xì)胞株均為三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)細(xì)胞株:MDA-MB-231、MDA-MB

3、-453、BT549、MDA-MB-436和MDA-MB-231-LU(指具有肺轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞亞系)，它們的半數(shù)抑制濃度(50％ inhibitory concentration，IC50)分別為(16.07±4.44)μM、(26.72±10.04)μM、(34.47±13.88)μM、(74.46±17.75)μM和(82.09±21.21)μM，并呈現(xiàn)劑量依賴性，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231經(jīng)非諾貝特處理24小時(shí)后細(xì)胞

4、形態(tài)明顯改變，活細(xì)胞數(shù)明顯減少。
　　2.非諾貝特能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，呈時(shí)間劑量依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)非諾貝特處理24小時(shí)后，PE AnnexinⅤ和7-AAD雙陽性的細(xì)胞比例0μM劑量組對(duì)100μM劑量組為4.8％對(duì)26.0％，上升了21.2％;非諾貝特處理48小時(shí)后，PE AnnexinⅤ和7-AAD雙陽性的細(xì)胞比例0μM劑量組對(duì)100μM劑量組為5.8％對(duì)48.0％，上升

5、了42.2％;不同時(shí)間點(diǎn)相比，48小時(shí)100μM劑量組的凋亡細(xì)胞比例對(duì)24小時(shí)100μM劑量組為48％對(duì)26％，增高了22％，其他劑量點(diǎn)也有不同比例的上升，并伴有Bad蛋白上調(diào)，Bcl-xl、Survivin下調(diào)，激活caspase-3。
　　3.非諾貝特能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞系出現(xiàn)G1期細(xì)胞周期阻滯。MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)非諾貝特處理24小時(shí)后，0μM和50μM劑量組的G1期細(xì)胞所占比例分別為49.2％對(duì)61.3％

6、;非諾貝特處理36小時(shí)后，0μM和50μM劑量組的分別為47.9％對(duì)61.5％，呈現(xiàn)劑量依賴性，并伴隨Cyclin D1、Cdk4蛋白水平的下調(diào)，p21、p27/Kip1蛋白水平的上調(diào)。
　　4.過氧化物酶增殖物激活受體-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha，PPAR-α)特異性抑制劑GW6471并不能逆轉(zhuǎn)非諾貝特抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

7、在MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)方面，非諾貝特各濃度組(0、12.5、25、50和100μM)的72小時(shí)生存率對(duì)非諾貝特各濃度組(0、12.5、25、50和100μM)聯(lián)合5μMGW6471的72小時(shí)生存率分別為(100±9.14)％對(duì)(99.90±9.23)％、(55.74±5.43)％對(duì)(58.60±4.10)％、(48.76±5.16)％對(duì)(41.43±3.66)％、(34.97±2.82)％對(duì)(28.92±2.94)％、(31.6

8、9±3.43)％對(duì)(25.71±2.84)％，各組p值均大于0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在MDA-MB-231細(xì)胞凋亡方面，單用50μM非諾貝特處理24小時(shí)和50μM非諾貝特聯(lián)合5μ GW6471處理24小時(shí)的凋亡細(xì)胞比例分別為(21.55±2.47)％和(20.15±1.34)％，p＞0.05，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.非諾貝特的抗腫瘤作用可能主要與NF-κB信號(hào)通路激活相關(guān)，另外，Akt1和Erk1/2信號(hào)通路的抑制也參與其抗

9、腫瘤作用。免疫印跡結(jié)果顯示，MDA-MNB-231細(xì)胞經(jīng)非諾貝特處理48小時(shí)后，NF-κB信號(hào)通路被激活，利用NF-κB通路的特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)能夠逆轉(zhuǎn)非諾貝特誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，單用50μM非諾貝特處理24小時(shí)后凋亡細(xì)胞比例達(dá)到(20.45±0.92)％，而50μM非諾貝特聯(lián)合10nM PDTC處理24小時(shí)后凋亡細(xì)胞比例降至（6.5±0.85）％，p＜0

10、.004，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.全基因表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，在基因本體(Gene ontology，GO)的生物過程變化最顯著的十個(gè)分類中，七個(gè)分類與細(xì)胞死亡相關(guān)，四個(gè)分類與細(xì)胞凋亡相關(guān)，下調(diào)最明顯的十條通路中，與細(xì)胞周期相關(guān)的通路排名第一，與腫瘤相關(guān)的通路排名第四。
　　7.非諾貝特能夠抑制MDA-MB-231移植瘤小鼠模型中的移植瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡。連續(xù)灌胃給藥32天后，非諾貝特治療組瘤體大小對(duì)對(duì)照組為（1

11、786.76±384.39）mm3對(duì)（2788.35±759.88）mm3，p＜0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，抑制率達(dá)35.92％; TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，非諾貝特治療組的凋亡細(xì)胞比例對(duì)對(duì)照組的凋亡細(xì)胞比例為（36.22±0.94）％對(duì)(17.84±6.60)％，p＜0.0001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在安全性評(píng)價(jià)方面，對(duì)照組和非諾貝特治療組在白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷