Cx43和Cx37在多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達及意義.pdf

1、多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育齡婦女最常見的一種極為復雜的內(nèi)分泌紊亂綜合征,以雄激素過多及持續(xù)無排卵為特征,發(fā)病率占育齡婦女的5％~10％。1935年由Stein和Leventhal兩位學者首先發(fā)現(xiàn),當時稱之為S—L綜合征。
　　傳統(tǒng)上認為PCOS的特點為過多雄激素、無排卵、不孕、多毛、肥胖和子宮內(nèi)膜癌風險,隨著臨床實踐及實驗研究的深入,最近認識到PCOS不僅涉及生殖系統(tǒng),而

2、且是一種代謝綜合征,常發(fā)生高胰島素血癥、高血脂、糖尿病和心血管疾病,在治療上涉及月經(jīng)失調(diào)、生育問題、子宮內(nèi)膜增生、遠期代謝合并癥等多學科問題。其發(fā)病機制目前還不清楚,是當前婦科內(nèi)分泌領域研究的一個難點和熱點。卵巢中的卵泡處于無血管的微環(huán)境中,在卵泡發(fā)育過程中,卵母細胞發(fā)育所需營養(yǎng)以及與外界的信號交流都要通過卵母細胞與周圍顆粒細胞以及顆粒細胞與膜細胞之間的細胞連接來實現(xiàn)。間隙連接是普遍存在于相鄰細胞間的細胞連接方式,它由一組名為間隙連接蛋

3、白(connexin,Cx)的膜蛋白組成。
　　間隙連接介導卵泡細胞間的代謝交換,傳遞內(nèi)分泌和旁分泌的信息物質(zhì),因而卵泡細胞間的間隙連接對于卵泡的發(fā)育、卵母細胞的成熟、以及甾類激素的分泌,都具有十分重要的意義。Cx43和Cx37是許多物種卵巢間隙連接中數(shù)量最豐富的兩種連接蛋白,與卵泡發(fā)育的關系最為密切。它們在卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育中必不可少的作用已經(jīng)確立。據(jù)報道,Cx43與腫瘤、分娩、心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)疾病均有一定關系。另

4、外,它還參與了凋亡、炎癥等過程。國內(nèi)外對Cx43的研究多集中在腫瘤和心血管系統(tǒng)。近年來對Cx43在卵巢發(fā)育中的作用研究也逐漸增多和深入。有研究顯示,在正常卵巢中,Cx43似乎擔當了一個抑癌因子的作用。它與卵巢腫瘤的發(fā)生密切相關。通過基因敲除小鼠研究顯示,Cx43的缺失導致了卵子發(fā)生、卵泡發(fā)育、排卵、和早期胚胎發(fā)育的嚴重受損。
　　它從以下幾個環(huán)節(jié)影響卵泡發(fā)育:對原始生殖細胞遷移和胚胎卵巢發(fā)育起關鍵作用;它保證了顆粒細胞的正常增殖和

5、分層,維持了卵泡的正常發(fā)育和結構;抗顆粒細胞凋亡,利于卵泡選擇;在卵母細胞減數(shù)分裂的恢復中起重要作用。另外,在卵巢重塑的關鍵時期:排卵、黃體形成、分化和退化中也起重要作用。許多激素及細胞因子如黃體酮、促黃體生成激素、促卵泡激素、生長激素等在轉錄、翻譯和表達等水平通過影響Cx43通道的開放、關閉時間,或使其磷酸化進行調(diào)節(jié)。在卵巢中,Cx37主要表達在卵母細胞與周圍顆粒細胞之間的間隙連接中,構成了二者物質(zhì)交流的通道。有研究報道,Cx37在卵

6、泡發(fā)育早期缺失,導致了卵泡發(fā)育停滯在竇前階段,竇狀卵泡較少;黃體化過程提前,卵母細胞過早停止發(fā)育,不能進行減數(shù)分裂;促性腺激素不能誘導卵泡發(fā)育成熟并排卵。因臨床取材困難,目前常用大鼠模型來進行PCOS發(fā)病機制的研究。
　　本研究通過建立來曲唑誘導的PCOS大鼠模型,應用免疫組化方法觀察Cx43和Cx37在正常及多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達變化,從而探討PCOS的發(fā)病機制。
　　材料與方法：
　　1、研究對象及分組選擇

7、6周齡清潔級雌性SD大鼠60只,所有大鼠由鄭州大學實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2005—0001,隨機分為實驗組、實驗對照組和空白對照組,每組20只。
　　2、方法
　　2.1 PCOS模型的建立實驗組大鼠灌胃服用溶于1％羧甲基纖維素(carboxmethlycellulose,CMC)的來曲唑1mg.(kg.d)-1,實驗對照組灌胃服用等容積的1％CMC,實驗組和實驗對照組均連續(xù)灌服21天;空白對照組不給

8、以任何刺激,正常飼養(yǎng)21天。此期所有大鼠須每日做陰道脫落細胞涂片巴氏染色后鏡檢監(jiān)測其動情周期的變化。2.2大鼠標本采集2.2.1實驗組大鼠在第21天應用來曲唑24h(并禁食12h)后處死取標本。2.2.2實驗對照組和空白對照組在飼養(yǎng)21天并禁食12h后處死取標本。2.2.3所有大鼠缺血法致死,取大鼠心臟血5ml,2000r/min離心10min,收集血清,-20℃凍存?zhèn)溆?。取出大鼠卵巢和子宮,分別稱重并記錄后,固定于福爾馬林中備用。2.

9、3大鼠卵巢組織學檢查以卵巢最大平面作為待檢平面行石蠟包埋,每個石蠟塊分別以4μm厚度連續(xù)切片兩次(間隔40μm),行蘇木素-伊紅(HE)染色。2.4大鼠血清性激素測定應用RIA法測定促黃體生成激素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P)、睪酮(testoterone,T),以評

10、定內(nèi)分泌改變。2.5大鼠卵巢組織中Cx43和Cx37的表達2.5.1應用免疫組化SP法進行組織染色,按照試劑盒說明書進行。2.5.2免疫組化染色結果判定標準:以PBS替代一抗作為陰性對照,以細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結果。陽性細胞必須符合下列要求:鏡下組織細胞結構清楚;陽性顆粒定位好;染色明顯高于背景。2.5.3拍片及測灰度值:拍攝免疫組化染色照片并保存。每張切片隨機觀察5個高倍鏡視野,采用Biosens Digital Imaging

11、 System系統(tǒng)進行圖像灰度值分析。2.6統(tǒng)計學方法采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示,多組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析,以a=0.05作為檢驗水準。
　　結果：
　　1、PCOS大鼠模型
　　1.1大鼠動情周期的變化:實驗組大鼠在應用來曲唑12天后動情周期失去規(guī)律性變化,均處于動情間期時相,提示無排卵;實驗對照組和空白對照組大鼠仍保持4天規(guī)律的動情周期。1.2大鼠卵巢、子宮大

12、體觀及組織學改變:實驗組大鼠卵巢表面較蒼白,體積增大;實驗對照組和空白對照組大鼠卵巢色澤較紅;實驗組大鼠卵巢重量顯著高于實驗對照組及空白對照組(P<0.05)。HE染色鏡檢,實驗組大鼠卵巢膜細胞層增厚,沿增厚的白膜下含有很多處于不同期的各級卵泡和閉鎖卵泡,囊狀擴張卵泡明顯增加;間質(zhì)細胞明顯增生,未見排卵前卵泡及排卵跡象,黃體罕見;實驗對照組和空白對照組大鼠卵巢可見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡,卵泡內(nèi)顆粒細胞呈多層,仍有排卵。實驗組大鼠子

13、宮重量顯著低于實驗對照組及空白對照組(P<0.05)。1.3鼠血清性激素測定:實驗組大鼠血清T、LH濃度顯著高于實驗對照組及空白對照組(P<0.05);實驗組大鼠血清FSH、E2、P濃度顯著低于實驗對照組及空白對照組(P<0.05)。
　　2、大鼠卵巢組織中Cx43和Cx37的表達在卵巢中Cx43主要在顆粒細胞間表達,在實驗組大鼠卵巢中表達水平顯著低于實驗對照組和空白對照組(P<0.05)。卵巢中Cx37主要在卵母細胞與周圍顆粒細