Sp1鋅指蛋白與鉑類抗腫瘤藥物的相互作用研究.pdf

1、盡管DNA被普遍認為是鉑類抗腫瘤藥物的作用靶點，然而越來越多的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)可能通過改變鉑類藥物的細胞攝取，胞內(nèi)傳遞路徑以及鉑損傷DNA修復(fù)等方式影響著腫瘤細胞對鉑類抗腫瘤藥物的敏感性。蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果表明，腫瘤細胞在鉑類抗腫瘤藥物的培養(yǎng)下，細胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)的表達水平發(fā)生了變化，表明鉑類藥物很可能通過影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程而影響腫瘤細胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞對順鉑藥物的敏感性。這一實驗現(xiàn)象也預(yù)示著鉑類抗腫瘤藥

2、物與轉(zhuǎn)錄因子之間存在著潛在作用，即鉑類抗腫瘤藥物通過直接或間接影響細胞內(nèi)一系列轉(zhuǎn)錄因子的功能，進而引發(fā)其下游基因轉(zhuǎn)錄表達過程的改變。由于鋅指蛋白家族作為細胞內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子成員以及鋅指在結(jié)構(gòu)上的特殊性，使得鋅指蛋白很可能是鉑類抗腫瘤藥物的潛在作用靶點。
　　 本論文圍繞Sp1鋅指蛋白與不同鉑配合物相互作用的研究，以及這種作用對Sp1鋅指蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。研究內(nèi)容涉及以下幾個方面:(1)比較了不同鉑化合物與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)活

3、性的差異，研究構(gòu)型和配體對鉑化合物與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)活性的影響;(2)我們在發(fā)現(xiàn)配體具有調(diào)控鉑化合物與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)活性這一現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，進一步討論了噻唑配體(Thiazole/Tz)調(diào)節(jié)鉑化合物對Sp1反應(yīng)活性的可能分子機制;(3)我們研究反應(yīng)體系微環(huán)境對順鉑與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)過程的影響，系統(tǒng)研究了還原劑Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)小分子促進順鉑與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)的分子機理。

4、>　　 第一章主要是對鋅指蛋白以及鉑類抗腫瘤藥物作用機理的綜述，內(nèi)容主要涉及鋅指蛋白在細胞內(nèi)分布的廣泛性和功能的重要性，鉑類抗腫瘤藥物的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系，蛋白在鉑類抗腫瘤藥物中的重要性，以及鋅指蛋白可能是鉑類抗腫瘤藥物在生物體內(nèi)的潛在作用靶點。
　　 第二章是Sp1鋅指蛋白與不同鉑化合物相互作用的研究。通過對Sp1鋅指蛋白與不同鉑化合物相互作用的研究，我們發(fā)現(xiàn)反式鉑噻唑化合物（trans-PtTz）對Sp1鋅指蛋白具有很強的反應(yīng)活

5、性，而其它鉑化合物對Sp1鋅指蛋白的反應(yīng)活性較弱。CD光譜和核磁共振實驗表明，反式鉑噻唑化合物可以有效破壞Sp1蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)。由于Sp1鋅指結(jié)構(gòu)是Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA并執(zhí)行基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的前提，我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，反式鉑噻唑化合物通過破壞Sp1蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)而抑制了Sp1轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。此外，我們在細胞水平上證明了反式鉑噻唑化合物與Sp1轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用的可能性，由于Sp1轉(zhuǎn)錄因子鋅指結(jié)構(gòu)的完整性是 Sp1蛋白從細胞質(zhì)到

6、細胞核穿梭過程所依賴的，我們在細胞水平上證實了反式鉑噻唑化合物通過破壞Sp1轉(zhuǎn)錄因子的鋅指結(jié)構(gòu)而抑制了Sp1蛋白從細胞質(zhì)到細胞核的穿梭過程。這些發(fā)現(xiàn)表明鉑化合物可能通過干擾細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的功能而影響其下游基因的表達，這個過程可能與反式鉑噻唑化合物的抗癌機理相關(guān)。
　　 第三章我們進一步討論了配體對鉑化合物與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)活性的影響。我們在研究不同配體的鉑化合物與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)活性差異的過程中發(fā)現(xiàn)，反式鉑噻唑化合物與Sp1

7、鋅指蛋白具有很強的反應(yīng)活性，而含其它配體的鉑化合物對Sp1鋅指蛋白的反應(yīng)活性較弱。這實驗現(xiàn)象充分表明配體可能在很大程度上調(diào)控鉑化合物對蛋白的反應(yīng)活性。首先，我們考查了配體在π堆疊效應(yīng)對鉑化合物與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)活性的影響，發(fā)現(xiàn)噻唑配體與吡啶配體對Sp1鋅指蛋白的π堆疊作用上具有類似的效應(yīng)。這說明反式鉑噻唑化合物對Sp1鋅指蛋白的高反應(yīng)活性并不是由噻唑配體對Sp1鋅指蛋白的π堆疊效應(yīng)所導(dǎo)致。我們進一步考察了芳香配體上游離的原子對鉑化合物

8、與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)活性的影響。實驗結(jié)果表明，芳香配體上游離原子的存在確實能很大程度上促進鉑化合物與Sp1鋅指蛋白之間的反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)一方面解釋了反式鉑噻唑化合物對Sp1鋅指蛋白具有高的反應(yīng)活性的原因，另一方面為通過改變鉑化合物的配體來設(shè)計一些對某些腫瘤蛋白具有較高選擇性的鉑化合物提供了思路。
　　 第四章我們研究了反應(yīng)體系微環(huán)境對順鉑(cisplatin)與Sp1鋅指蛋白反應(yīng)的影響。已有一些文獻報道，順鉑可有效破壞鋅指蛋白的鋅

9、指結(jié)構(gòu)域，并導(dǎo)致其鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)Zn2+的逐出和鋅指結(jié)構(gòu)的喪失。然而我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，順鉑對Sp1鋅指蛋白的反應(yīng)活性很弱。我們對比已有報道文獻的反應(yīng)過程與自己的實驗過程，并通過實驗證明了反應(yīng)體系中添加Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)還原劑可以在很大程度上促進了順鉑與Sp1鋅指蛋白之間的作用。我們對反應(yīng)機理進一步研究發(fā)現(xiàn)，TCEP還原劑通過磷原子取代順鉑上的Cl-，極大活化順鉑反位上NH3并導(dǎo)致N