自然流產(chǎn)性別特異性胚胎淘汰及其發(fā)生機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　 自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科的一種常見病,其發(fā)生率約占臨床妊娠的10～0％,且近年來(lái)還呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。在迄今為止所發(fā)現(xiàn)的眾多的復(fù)雜病因中,遺傳因素,尤其是染色體異常,是公認(rèn)的最為常見的自然流產(chǎn)誘發(fā)因素。本文擬從對(duì)流產(chǎn)絨毛直接進(jìn)行X染色體失活調(diào)查入手,研發(fā)基于STR(short tandem repeat)位點(diǎn)的以DHPLC(denature high performance liquidchromatography

2、,變性高效液相色譜)為技術(shù)平臺(tái)的X染色體失活診斷體系,查明自然流產(chǎn)中女性絨毛的X染色體失活情況,并同時(shí)結(jié)合調(diào)查母體體細(xì)胞(外周血)的X染色體失活情況,綜合分析和探討女性胚胎自然流產(chǎn)高發(fā)的發(fā)生機(jī)制。我們?cè)O(shè)想,由于異常的X染色體失活造成的自然流產(chǎn),有三種可能:(1)母體X失活正常,但絨毛X失活異常,如母源性X染色體出現(xiàn)失活或父源性X染色體未完全失活,引起流產(chǎn)。(2)絨毛X失活正常,但母體X失活異常,且將高失活的X染色體傳遞給絨毛,引起流產(chǎn)。

3、(3)絨毛和母體X失活均異常,引起流產(chǎn)。X染色體失活正常則存在兩種可能:(1)絨毛X失活正常,母體X失活異常,但將高活性的X染色體傳遞給了絨毛；(2)絨毛和母體X失活均正常。
　　 材料與方法：
　　 1.樣品的選擇及標(biāo)準(zhǔn):本研究選取167個(gè)早期自然流產(chǎn)家系,包括絨毛標(biāo)本及父母雙方外周血,要求8～11孕周,B超提示胚胎停止發(fā)育,孕婦年齡為30.84±5.28(21～43歲)及116個(gè)早期人工流產(chǎn)家系,包括絨毛標(biāo)本及母親外

4、周血,要求8～11孕周,孕婦年齡為29.60±4.47(23～48歲),排除免疫、感染、外傷等影響因素,行清宮術(shù)時(shí)予以無(wú)菌收集。
　　 2.自然流產(chǎn)及人工流產(chǎn)絨毛染色體核型分析:采用絨毛細(xì)胞培養(yǎng)法或絨毛細(xì)胞直接制備法獲取絨毛細(xì)胞染色體,進(jìn)行G顯帶核型分析,用于發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)最常見的誘發(fā)因素--染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常,并確定胚胎性別,為下一步的研究提供分組依據(jù)。
　　 3.X染色體失活DHPLC診斷體系的建立:
　　

5、(1)特異性STR位點(diǎn)選擇及PCR引物設(shè)計(jì)。選用位于X染色體q11-12的雄激素受體(human androgen receptor,AR)基因第一外顯子的一個(gè)三堿基(CAG)STR位點(diǎn),重復(fù)次數(shù)為8～31次,雜合度為88.8％,進(jìn)行引物設(shè)計(jì),PCR擴(kuò)增,片段長(zhǎng)度約為200～300bp。
　　 (2)所選STR位點(diǎn)的實(shí)際雜合度的檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)。對(duì)422例女性標(biāo)本,排除染色體核型異常后,進(jìn)行基因組DNA抽提,PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物在

6、DHPLC非變性條件下(50℃)進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的雜合峰個(gè)數(shù),計(jì)算實(shí)際雜合度。實(shí)際雜合度=STR位點(diǎn)為雜合峰的個(gè)數(shù)/總樣本個(gè)數(shù)。
　　 (3)甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶消化及內(nèi)參基因的設(shè)置。用HpaII對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切,并使用MIC2基因作為內(nèi)參基因以判斷酶切效果。
　　 (4)雙重PCR/DHPLC檢測(cè)方法的建立。針對(duì)STR及MIC2基因位點(diǎn)建立雙重PCR體系,擴(kuò)增酶切前、后的DNA標(biāo)本,在DHPLC非變性條

7、件下,根據(jù)PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度及STR位點(diǎn)堿基數(shù)優(yōu)化洗脫梯度。
　　 (5)聚丙烯酰胺凝膠電泳和測(cè)序:選取2例樣本進(jìn)行測(cè)序分析,選取1個(gè)家系進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,用于檢驗(yàn)非變性條件下DHPLC的靈敏度。
　　 4.自然流產(chǎn)婦女體細(xì)胞X染色體失活與自然流產(chǎn)關(guān)系的研究:對(duì)165例自然流產(chǎn)婦女以及106例人工流產(chǎn)婦女,進(jìn)行基因組DNA抽提,HpaⅡ消化,采用上述的雙重PCR/DHPLC進(jìn)行X染色體失活檢測(cè)。結(jié)果采用失

8、活比例(d1/u1)/(d1/u1+d2/u2)(d表示消化過(guò)的峰高,u表示未消化時(shí)的峰高)進(jìn)行計(jì)算,分別以失活比例>70％和失活比例>90％作為判斷SXCI的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 5.自然流產(chǎn)性別特異性胚胎淘汰與X染色體失活關(guān)系的家系研究:對(duì)105個(gè)自然流產(chǎn)女性胚胎家系(包括絨毛與雙親外周血,其中53個(gè)絨毛為正常核型,52個(gè)絨毛為異常核型)和53個(gè)人工流產(chǎn)正常女性核型家系(包括絨毛與母親外周血),進(jìn)行基因組DNA抽提,HpaⅡ消化,雙

9、重PCR/DHPLC進(jìn)行X染色體失活檢測(cè)。絨毛SXCI判斷標(biāo)準(zhǔn):酶切后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如仍有母源的峰(失活X染色體)即為絨毛SXCI。母親SXCI判斷標(biāo)準(zhǔn):采用失活比例>70％為失活偏移標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果與討論：
　　 在167例自然流產(chǎn)絨毛中,培養(yǎng)成功165例,成功率98.8％。檢測(cè)出染色體核型異常例數(shù)88例,異常率為53.3％(其中男性異常率60.0％,女性異常率49.5％),異常率與文獻(xiàn)報(bào)道相符。這一結(jié)果提示了對(duì)早期

10、自然流產(chǎn)絨毛進(jìn)行染色體核型分析的重要性,如果能對(duì)染色體異常的流產(chǎn)胚胎進(jìn)行明確判斷,將能對(duì)至少50％以上的早期自然流產(chǎn)夫婦進(jìn)行病因診斷,使其免除其他無(wú)謂的檢查,并得到針對(duì)性的明確的生育指導(dǎo)。通過(guò)核型分析,還證實(shí)了自然流產(chǎn)胚胎男女比例偏移,本研究培養(yǎng)成功的165例自然流產(chǎn)絨毛中,男性胚胎60例,女性胚胎105例,男女性別比例為1:1.8。116例人工流產(chǎn)絨毛標(biāo)本中,可進(jìn)行核型分析的標(biāo)本106例,其中男性胚胎53例,女性胚胎53例,男女比例為

11、1:1。自然流產(chǎn)組與人工流產(chǎn)組流產(chǎn)胚胎性別比例存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.026)。
　　 使用自行設(shè)計(jì)的引物,對(duì)AR基因上的STR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示,422例標(biāo)本中,該位點(diǎn)為雜合子的標(biāo)本346例,實(shí)際雜合度為82.0％,略低于文獻(xiàn)報(bào)道的88.8％。而MIC2基因作為內(nèi)參基因有助于判斷酶切是否完全,經(jīng)過(guò)抽樣測(cè)序分析和聚丙烯酰胺凝膠電泳的雙重驗(yàn)證,證實(shí)所建立的雙重PCR/DHPLC的檢測(cè)效果完全符合理想,是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、敏感、可靠

12、與經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)技術(shù)體系,適合下一步的研究和臨床應(yīng)用需要。
　　 自然流產(chǎn)婦女體細(xì)胞SXCI與自然流產(chǎn)是否存在關(guān)聯(lián),在以往的文獻(xiàn)中結(jié)論不一。本研究中,165例自然流產(chǎn)婦女平均年齡30.84±5.28(21～43歲),106例人工流產(chǎn)婦女平均年齡29.60±4.47(23～48歲),兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.077),且兩組均為8～11孕周。檢測(cè)結(jié)果顯示,采用>70％的標(biāo)準(zhǔn)時(shí),21.9％(30/137)的自然流產(chǎn)與12.8％(

13、11/86)的人工流產(chǎn)婦女為SXCI；采用更為嚴(yán)格的>90％標(biāo)準(zhǔn)時(shí),8.0％(10/137)的自然流產(chǎn)與2.3％(2/86)的人工流產(chǎn)婦女為SXCI。上述兩種情況下,兩組間的SXCI發(fā)生率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.087及p=0.195),只依據(jù)婦女體細(xì)胞SXCI指標(biāo)無(wú)法得到婦女SXCI與自然流產(chǎn)相關(guān)的結(jié)論。同時(shí),在自然流產(chǎn)SXCI婦女相應(yīng)的胚胎中,女性胚胎占80.0％(24/30),而非SXCI婦女中,流產(chǎn)女性胚胎占54.2％(58/1

14、07),兩組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.011),即婦女SXCI與胚胎特異性性別淘汰相關(guān)聯(lián),當(dāng)母親發(fā)生SXCI時(shí),更易淘汰女性胚胎。同時(shí),SXCI婦女的流產(chǎn)胚胎中三體型的比例(50.0％,15/30),高于非SXCI婦女(30.0％,32/107),P=0.040,提示婦女SXCI與三體的發(fā)生和流產(chǎn)之間可能存在某種聯(lián)系。
　　 在針對(duì)自然流產(chǎn)正常女性核型家系、自然流產(chǎn)異常女性核型家系以及人工流產(chǎn)正常女性核型家系所進(jìn)行的x染色體失活檢

15、測(cè)結(jié)果顯示:53個(gè)自然流產(chǎn)正常女性核型家系中,40個(gè)能區(qū)分X染色體來(lái)源,而且85.0％(34/40)存在x染色體失活異常(包括28個(gè)為絨毛異常、4個(gè)為絨毛與母體均異常、2個(gè)為母體異常且傳遞給絨毛)；52個(gè)自然流產(chǎn)異常女性核型家系中,36個(gè)能區(qū)分x染色體來(lái)源,83.3％(30/36)存在x染色體失活異常(包括19個(gè)為絨毛異常、6個(gè)為絨毛與母體均異常、5個(gè)為母體異常且傳遞給絨毛)；而53個(gè)人工流產(chǎn)女性正常核型家系中,41個(gè)能區(qū)分X染色體來(lái)源

16、,而X染色體失活異常的比例僅為39.0％(16/41),而且其中15例為絨毛異常,僅1例為母體異常傳遞給絨毛。上述結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,顯示自然流產(chǎn)正常與異常女性核型組的X失活異常率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.0125),但此二組的X失活異常率均明顯高于人工流產(chǎn)正常女性核型組(P值分別<0.00313),說(shuō)明女性胚胎自然流產(chǎn)與X染色體失活異常,尤其是絨毛X染色體失活異常密切相關(guān),而且x染色體失活有可能是獨(dú)立于染色體異常之外的一種自然流產(chǎn)發(fā)病因素,

17、其發(fā)生不受染色體正常與否所影響。
　　 結(jié)論：
　　 早期自然流產(chǎn)中存在著女性胚胎特異性淘汰現(xiàn)象,而X染色體失活是女性胚胎發(fā)育早期的重要事件。通過(guò)綜合比較自然流產(chǎn)與人工流產(chǎn)絨毛及流產(chǎn)婦女外周血x染色體失活情況,本研究發(fā)現(xiàn)女性胚胎自然流產(chǎn)與X染色體失活,尤其是絨毛x染色體失活異常密切相關(guān),而且X染色體失活異常很可能是獨(dú)立于染色體異常之外的一種自然流產(chǎn)發(fā)病因素。而婦女SXCI是否與女性胚胎自然流產(chǎn)相關(guān)聯(lián),取決于所下傳的X染色

18、體,將高失活X染色體傳遞給胚胎是造成女性胚胎自然流產(chǎn)的重要因?yàn)?也是SXCI婦女高發(fā)女性胚胎淘汰的因?yàn)樗?。同時(shí),婦女SXCI與三體的形成之間可能存在某種聯(lián)系,SXCI婦女的流產(chǎn)胚胎中三體型的比例顯著增高。此外,本研究所建立的X染色體失活DHPLC診斷方法具有靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),適合在臨床中應(yīng)用于女性胚胎自然流產(chǎn)的病因查找,可為85％左右的女性胚胎自然流產(chǎn)的發(fā)生找到發(fā)病的根本因?yàn)?。進(jìn)一步深入探索并揭開女性胚胎發(fā)生X染色體失