FMR1基因敲除小鼠聽源性癲癇的生化機(jī)制及其柴胡桂枝湯揮發(fā)油的干預(yù)作用.pdf

1、目的：
　　 癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病之一，是由多種病因引起的慢性腦性疾病，以大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電所致的突然、反復(fù)和短暫的大腦功能障礙為特征，是影響人類健康的一大類疾患。這種神經(jīng)元的異常放電與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、遺傳及免疫的異常有著密切的關(guān)系。目前對(duì)癲癇的實(shí)驗(yàn)研究，多采用傳統(tǒng)的點(diǎn)燃模式—化學(xué)點(diǎn)燃?；瘜W(xué)點(diǎn)燃的藥物主要有戊四氮、匹羅卡品、青霉素及美解眠等。
　　 臨床上對(duì)癲癇的治療，大多都是使用西藥來控制癲

2、癇的發(fā)作，但常用的西藥均具有明顯的毒副作用。中藥治療癲癇具有療效確切、毒副作用少等優(yōu)勢(shì)。柴胡桂枝湯在臨床上具有明顯的抗癲癇作用，但機(jī)理不明。明確癲癇發(fā)病機(jī)制，將有利于癲癇的診斷、預(yù)防與治療。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬用FMR1基因敲除小鼠作為模型，從空間認(rèn)知功能、突觸重建、動(dòng)物行為學(xué)、自由基產(chǎn)生與消除、氨基酸水平等方面，研究癲癇發(fā)病機(jī)制及柴胡桂枝湯對(duì)癲癇的干預(yù)作用，為該組方將來開發(fā)成為新型的抗癲癇藥物打下堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。
　　

3、 方法：
　　 1.FMR1基因敲除小鼠癲癇模型的初步研究選擇4周、6周、8周不同年齡組的正常的野生型小鼠（WT）和FMR1基因敲除小鼠（KO），以相同實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行5天的Morris水迷宮學(xué)習(xí)與記憶測(cè)試，包括前4天的定位航行實(shí)驗(yàn)和第五天的空間探索實(shí)驗(yàn)。
　　 選擇0天、2周、4周不同年齡組的正常的野生型小鼠（WT）和FMR1基因敲除小鼠（KO），用免疫組化的方法觀察EphA2在兩種鼠腦不同部位的表達(dá)。
　　 2.

4、FMR1基因敲除小鼠聽源性癲癇及柴胡桂枝湯揮發(fā)油抗癲癇生化機(jī)制的研究選擇4周齡的正常的野生型小鼠（WT）和FMR1基因敲除小鼠（KO），腹腔注射不同濃度的柴胡桂枝湯揮發(fā)油，運(yùn)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)方法，觀察動(dòng)物行為學(xué)的指標(biāo)及建立一個(gè)有效藥物濃度曲線。
　　 將4周齡的WT和KO小鼠分別分作三組，即未作任何處理的對(duì)照組、腹腔注射植物油的空白組、腹腔注射柴胡桂枝湯揮發(fā)油的用藥組。利用鄰苯三酚自氧化法、硫代巴比妥法、硝酸還原酶法分別檢測(cè)超氧化物歧

5、化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）的水平，以用來比較三組不同處理的小鼠這三種物質(zhì)水平的改變。
　　 與此同時(shí)，我們還采用高效液相色譜的方法來檢測(cè)三組不同處理的小鼠氨基酸水平的變化，以更全面地研究癲癇發(fā)病機(jī)制。
　　 3.柴胡桂枝湯揮發(fā)油成分氣相色譜-質(zhì)譜分析利用超臨界CO2萃取技術(shù)制備柴胡桂枝湯揮發(fā)油，并用氣相色譜-質(zhì)譜方法對(duì)其進(jìn)行分析和鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1.Morris水迷宮試

6、驗(yàn)結(jié)果在定位航行實(shí)驗(yàn)中，4、6、8周齡FMR1基因敲除小鼠（KO）的逃避潛伏期與同周齡野生型小鼠(WT)相比有差異,較同周齡野生型小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)。同時(shí)，4、6、8周齡小鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中，穿過平臺(tái)次數(shù)的比較，KO組明顯少于WT組；停留在平臺(tái)區(qū)域所用時(shí)間的比較，KO組也明顯短于WT組(P<0.05)。
　　 2.EphA2在鼠腦中表達(dá)的結(jié)果EphA2蛋白在新生小鼠的海馬、皮層表達(dá)豐富。海馬以陽性細(xì)胞為主，尤其是

7、CA3區(qū)陽性細(xì)胞表達(dá)顯著；皮質(zhì)則是有陽性細(xì)胞和陽性纖維雙重表達(dá)。在0天、2周、4周不同年齡組的小鼠中，KO組小鼠EphA2在海馬和皮質(zhì)的表達(dá)，明顯高于WT組小鼠。（P<0.05)。
　　 3.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果未用藥的WT組和KO組小鼠比較，KO組小鼠的運(yùn)動(dòng)性、興奮性、探索性明顯高于WT組小鼠。隨著柴胡桂枝湯揮發(fā)油濃度的增加，KO和WT小鼠的平均速度、運(yùn)動(dòng)軌跡及穿越中央格次數(shù)均逐漸降低。
　　 4.SOD、MDA、NO水平測(cè)

8、定的結(jié)果WT空白組小鼠與WT對(duì)照組小鼠比較，WT空白組小鼠的SOD活力、MDA和NO水平均增高；WT用藥組小鼠與WT空白組小鼠比較，WT用藥組小鼠的SOD活力增高，而MDA和NO水平均降低。（P＜0.05）
　　 KO空白組小鼠與KO對(duì)照組小鼠比較，KO空白組小鼠的SOD活力降低，而MDA和NO水平均增高；KO用藥組小鼠與KO空白組小鼠比較，KO用藥組小鼠的SOD活力增高，而MDA和NO水平均降低。（P＜0.05）
　　

9、 5.氨基酸水平的測(cè)定結(jié)果WT空白組小鼠與WT對(duì)照組小鼠比較，WT空白組小鼠腦組織中γ-氨基丁酸水平和甘氨酸明顯降低，而谷氨酸水平則明顯升高；與此同時(shí)WT空白組小鼠與WT用藥組小鼠比較，WT空白組小鼠腦組織中谷氨酸水平明顯高于WT用藥組（P＜0.05）
　　 KO空白組小鼠與KO對(duì)照組小鼠比較，KO空白組小鼠腦組織中γ-氨基丁酸水平明顯降低；與此同時(shí)KO空白組小鼠與KO用藥組小鼠比較，KO空白組小鼠腦組織中谷氨酸水平明顯高于KO

10、用藥組（P＜0.05）
　　 6.柴胡桂枝湯揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜分析（GC – MS）結(jié)果經(jīng)GC-MS分析，確定并鑒定出了其中的28種組分。其中,揮發(fā)油組分中,最主要的成分姜辣素占31.94％ （其中姜烯占19.75％、α-姜黃烯占7.36％、順式-6-姜烯酚占4.83％）,丁香酚占18.01％，單萜類物質(zhì)占12.34％（其中β-倍半水芹烯占7.98％、β-紅沒藥烯占3.90％、α-可巴烯占0.46％），3-丁基-1(3H)-

11、異苯并呋喃酮（又名丁基苯酞）占9.34％ ,肉桂類物質(zhì)占8.03％。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)采用的FMR1基因敲除癲癇小鼠模型類似人類的癲癇發(fā)作，且具備學(xué)習(xí)和記憶能力缺損，是研究癲癇比較理想的動(dòng)物模型。EphA2受體是一種軸突導(dǎo)向分子，可能參與了腦組織結(jié)構(gòu)軸突出芽和突觸重構(gòu)的過程，為FMR1基因敲除小鼠易發(fā)癲癇提供了一條新的思路。
　　 2.FMR1基因敲除小鼠聽源性癲癇可能與興奮性氨基酸/抑制性氨基酸的

12、比例失衡相關(guān)，同時(shí)大量自由基的產(chǎn)生、過氧化物生成及NO神經(jīng)毒性也可能在致癇過程中起到了一定的作用。
　　 3.柴胡桂枝湯揮發(fā)油的抗癲癇作用可能與降低興奮性氨基酸/抑制性氨基酸的比值有關(guān)，再者其有效清除自由基、阻止過氧化物生成，減少NO的神經(jīng)毒性等藥理作用，在一定程度上，能減少癲癇發(fā)作的次數(shù)，具有保護(hù)腦細(xì)胞的作用。
　　 4.柴胡桂枝湯揮發(fā)油中姜辣素、單萜類物質(zhì)、丁基苯酞、丁香酚等主要成分可能在柴胡桂枝湯揮發(fā)油的抗氧化與抗