mGluR5拮抗劑MPEP對FMR1基因敲除小鼠神經元樹突棘的影響及機制探討.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、脆性X 綜合征是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一,臨床癥狀表現為不同程度的智力低下、注意力缺陷、強迫癥、自閉癥等。FMR1 基因(fragile X mentalretardation 1)三核苷酸重復序列異常擴增,使其編碼產物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)減少或缺失而致病。研究發(fā)現脆性X綜合征患者和FMR1基因敲除小鼠都存在樹突棘發(fā)育異常。由于樹突棘是突觸后膜的

2、主要結構,因此普遍認為樹突棘形態(tài)異常導致的突觸可塑性改變可能是導致脆性x綜合征臨床表現的病理基礎?,F在已證實FMRP是一種翻譯抑制因子,它特異性與某些mRNA結合抑制其蛋白的表達,推測FMRP可能通過調節(jié)與神經系統(tǒng)發(fā)育有關的蛋白合成來發(fā)揮作用。已證實FMRP蛋白包含有MAP1B mRNA結合位點,也有研究表明脆性 X 綜合征果蠅和小鼠模型腦組織中微管相關蛋白1B(microtubule associated protein 1B,MAP

3、1B)的含量增加,增加的MAP1B與樹突棘的發(fā)育密切相關,推測FMRP可能通過調節(jié)MAP1B的表達影響樹突棘的形態(tài)。由于脆性 X 綜合征第1組代謝性谷氨酸受體 (metabotropic glutamatereceptor I,mGluR I)依賴的蛋白翻譯增強;mGluR I激動劑能使海馬神經元產生類似于FMR1基因敲除小鼠的樹突棘改變,并導致實驗動物產生脆性 X 綜合征相似的臨床癥狀;因此推測mGluR I過度激活所致的神經發(fā)育蛋白

4、過表達可能在脆性綜合征發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。最近的研究顯示mGluR I抑制劑能夠部分逆轉脆性X綜合征小鼠模型行為異常,改善脆性X綜合征果蠅模型求偶能力和蘑菇型樹突棘缺陷;我們的前期研究結果也己證實抑制mGluR I能部分逆轉培養(yǎng)FMR1基因敲除小鼠神經元樹突棘形態(tài)異常和MAPlB表達異常。這些結果進一步說明脆性X綜合征存在mGluR I過度激活。然而,脆性 X 綜合征樹突棘的形態(tài)異常是否由于mGluR I過度激活使MAPlB過表達所

5、致,在體的情況下mGluR I拮抗劑是否也可以逆轉FMR1基因敲除小鼠樹突棘發(fā)育異常,不同干預時機和干預時間的長短對樹突棘發(fā)育有無影響,有待進一步研究。mGluR I包括mGluR1和mGLuR5兩種亞型,最近的幾項研究提示mGlLuR5可能在脆性X綜合征的發(fā)病機制中發(fā)揮更重要的作用。因此,本研究通過給予新生和成年FMR1基因敲除小鼠mGluR5特異性拮抗劑MPEP處理,觀察mGluR5功能改變對樹突棘發(fā)育和MAP1B表達的影響,初步探

6、討mGluR5在脆性X綜合征發(fā)病機制中的作用及機理;同時通過在體條件下觀察MPEP不同干預時機和干預時間長短對樹突棘發(fā)育的影響,為尋找有效的治療方案提供一定的依據。 材料與方法: FVB品系小鼠飼養(yǎng)在19~21℃自然光條件下,自由獲取食物和水分。實驗前取尾靜脈血提取DNA,PCR技術進行基因型鑒定。將新生1天和出生6周(成年)的雄性FMR1基因敲除(FMR1 knockout,KO)小鼠分別隨機分為干預1周組(KOtlw

7、)和1周空白對照組(KOclw)、干預2周組(KOt2w)和2周空白對照組(KOc2w)。并以同齡野生小鼠(wild type mouse,WT)作為野生對照組(WTclw、WTc2w)。干預組分別于新生1天和出生6周開始給予腹腔注射MPEP 20mg/(kg.d),兩對照組則予等量生理鹽水腹腔注射,每天1次。新生K0小鼠增設MPEP干預1天組(KOtld),自出生第1天開始注射生理鹽水,第7天給予MPEP注射1次。以上各組注射時間固定

8、于上午10:00~11:00。新生小鼠每組10只,Golgi染色和免疫印跡兩種試驗方法各用5只;成年小鼠每組5只,用于Golgi染色。用于Golgi染色的實驗小鼠在接受最后1次注射3 h后取腦,以單片Golgi染色方法觀察樹突棘的長度、密度和形態(tài)。用于免疫印跡的新生小鼠于最后1次注射3h后抽取全腦蛋白,用免疫印跡方法檢測MAP1B的表達。 結果: 1.KO和WT小鼠樹突棘特點在新生和成年KO鼠的空白對照組(KOc,包括K

9、Oclw和KOc2w)與同齡野生對照組相比樹突棘長度都明顯增長(P<0.05),不成熟樹突棘比例顯著增加(P<0.05)。除新生鼠2周的空白對照組(KOc2w)外,其它KOc組較同齡WTc組樹突棘密度顯著增加(P<0.01)。 2.MPEP對成年和幼年KO小鼠樹突棘發(fā)育的影響 2.1 MPEP對KO小鼠樹突棘長度的影響對于新生KO小鼠,MPEP 1天干預不改變樹突棘的長度(P>0.05);MPEP連續(xù)干預1周樹突棘長度較

10、空白對照組明顯縮短(P<0.01),但與野生對照組仍有差異(P<0.05);連續(xù)干預2周較空白對照組顯著縮短(P<0.01),與野生對照組無明顯差別(P>0.05)。對于成年KO小鼠,MPEP連續(xù)干預1周、2周樹突棘長度均無改變(P>0.05)。 2.2 MPEP對KO小鼠樹突棘密度的影響對于新生KO小鼠,MPEP 1天干預不影響樹突棘密度(P>0.05),MPEP干預1周可使樹突棘密度較空白對照組顯著降低(P<0.05),與野

11、生對照無明顯差別(P>0.05);MPEP干預2周對樹突棘密度無影響(P>0.05)。對于成年KO小鼠,MPEP干預1周不影響樹突棘的密度(P>0.05),干預2周可使樹突棘密度明顯降低(P<0.05)。 2.3 MPEP對KO小鼠樹突棘形態(tài)的影響給予新生KO小鼠MPEP干預1周、2周均可使其不成熟樹突棘比例明顯減少(P<0.05),成熟樹突棘比例顯著增加(P<0.05);MPEP 1天干預不改變KO小鼠樹突棘的形態(tài)(P>0.0

12、5)。對于成年KO小鼠,MPEP干預1周、2周對樹突棘的形態(tài)影響不明顯(P>0.05)。 3.MPEP對幼年KO小鼠腦內MAP1B表達的影響新生KO鼠1周和2周的空白對照組MAP1B的表達較同齡WTc小鼠顯著增加(P<0.01)。MPEP干預1次可明顯減少1周空白對照組MAP1B的表達(P<0.05);給予新生KO小鼠MPEP干預1周、2周均可使MAP1B的表達有更明顯的降低(P<0.01),與野生對照已無明顯差別(P>0.05

13、)。 小結: 1.幼年和成年的FMR1基因敲除小鼠均表現不成熟的樹突棘增多,樹突棘增長和密度增加,表明FMRP在樹突棘發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,其表達缺失可導致樹突棘發(fā)育異常。 2.MPEP干預1周和2周可明顯逆轉新生FMR1基因敲除小鼠樹突棘長度及形態(tài)異常,干預1周FMR1基因敲除小鼠樹突棘密度明顯降低。這提示脆性X綜合征樹突棘發(fā)育異常與FMRP缺失導致mGluR5信號過度激活有關,這可能是mGluR5拮抗劑發(fā)揮

14、治療作用的基礎。 3.FMR1 基因敲除小鼠MAP1B表達顯著增加,MPEP干預可以明顯降低FMR1基因敲除小鼠MAP1B表達,表明mGluR5可能通過調節(jié)MAP1B的表達影響樹突棘發(fā)育。 4.MPEP對新生鼠的干預有效,而對成年FMR1基因敲除小鼠樹突棘形態(tài)影響不明顯,提示mGluR5信號過度活動主要影響幼年FMR1基因敲除小鼠樹突棘發(fā)育。MPEP 1次干預不影響樹突棘的形態(tài),表明mGluR5信號影響樹突棘發(fā)育需要較長

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