肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)研究.pdf

1、急性肝功能衰竭(acuteliverfailureALF)是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，病情危重，進(jìn)展迅速，預(yù)后兇險(xiǎn)，病死率高。目前，唯一有效的治療是原位肝移植。然而，由于供體器官缺乏、圍手術(shù)期成本高和手術(shù)復(fù)雜、需長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等原因，病人往往在等待供體的過程中由于病情進(jìn)展而迅速死亡，極大地限制了肝移植手術(shù)的廣泛開展?；诖朔N前提下，生物人工肝支持系統(tǒng)逐步成為治療肝功能衰竭的另一重要手段。生物人工肝能清除患者體內(nèi)蓄積的各種有害物質(zhì)，補(bǔ)充必

2、需物質(zhì)，改善內(nèi)環(huán)境，暫時(shí)替代衰竭肝臟的部分功能，為肝臟再生創(chuàng)造條件，作為通向肝移植的橋梁，降低患者的病亡率，目前已成為僅次于肝移植手術(shù)治療肝功能衰竭的最佳治療手段。
　　 生物人工肝的核心為反應(yīng)器中的肝細(xì)胞，生物人工肝對(duì)肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細(xì)胞的生物學(xué)功能。通常，肝細(xì)胞的生長(zhǎng)有賴于血清的存在，在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分肝細(xì)胞不能增值。血清的主要作用在于提供細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的激素、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移

3、蛋白和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂增殖。然而在生物人工肝的治療過程中，由于反應(yīng)器中殘留血清的肝細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或病人血液直接接觸，易引起過敏反應(yīng)，影響治療效果甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。所以，清除生物人工肝中殘留的血清就顯得尤為重要，也是生物人工肝面臨的亟待解決的問題之一。
　　 同時(shí)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清還存在著多種缺點(diǎn):首先，具有批間差異、不同批次血清間的生物活性和因子的不一致，導(dǎo)致產(chǎn)品和實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果的重現(xiàn)性差，需要大量驗(yàn)證工作;其次，血清的來源不穩(wěn)定，成分不明確、有抑制生長(zhǎng)的成分、不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化;最后，存在污染外源病毒和致病因子的風(fēng)險(xiǎn)，容易被病毒和支原體感染。
　　 因此，許多科學(xué)家開始進(jìn)行無血清培養(yǎng)基的研究。無血清培養(yǎng)基是加入成分明確的血清替代成分，既能滿足細(xì)胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因而無血清培養(yǎng)基得到了越來越普遍的應(yīng)用，無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究日益得到人們的

5、重視。
　　 綜上所述，本研究將致力于肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)研究。通過無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細(xì)胞系，使其與傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)，在細(xì)胞數(shù)量、活力和功能等方面，達(dá)到同樣的效果，從而解決了血清的存在帶來的種種弊端，同時(shí)為肝細(xì)胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定基礎(chǔ)。具體包括以下兩部分研究?jī)?nèi)容:
　　 一:一種適合肝細(xì)胞生長(zhǎng)的無血清培養(yǎng)基;
　　 二:四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細(xì)胞的比較研究。
　　 第一部分:一種適

6、合肝細(xì)胞生長(zhǎng)的無血清培養(yǎng)基
　　 目的:
　　 研發(fā)一種適用于肝細(xì)胞(C3A)生長(zhǎng)的無血清培養(yǎng)基，為肝細(xì)胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)按細(xì)胞培養(yǎng)基的不同分為3組:分別為無血清培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng);采取逐步降低血清濃度的方法培養(yǎng)C3A細(xì)胞，使細(xì)胞耐受培養(yǎng)基的改變以及適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng);細(xì)胞穩(wěn)定后，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和活力曲線觀察，全自

7、動(dòng)生化分析儀測(cè)定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法檢測(cè)白蛋白分泌量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因水平的變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 三組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均正常，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，胞漿透亮豐富，貼壁情況良好;細(xì)胞在接種24小時(shí)后開始增長(zhǎng)，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞數(shù)逐漸增多達(dá)到最大值后逐漸下降。實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組，細(xì)胞生長(zhǎng)至第五天到達(dá)最大值，分別為(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后

8、開始下降;而陽性對(duì)照組，細(xì)胞生長(zhǎng)至第七天達(dá)到峰值，為(3.50±0.060)×106。實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組的細(xì)胞增長(zhǎng)速度相近，細(xì)胞密度在培養(yǎng)周期內(nèi)，除第六、七天(p=0.000，p=0.000)以外，無明顯差異(p＞0.05)。而在培養(yǎng)的第三天至第八天，明顯高于陰性對(duì)照組(P=0.000);培養(yǎng)的第五天開始，無血清培養(yǎng)基組和完全培養(yǎng)基組的細(xì)胞活力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.429)并明顯高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(P＜0.001);無血清培養(yǎng)基組的尿素合成

9、水平在培養(yǎng)的第二天起明顯高于其余兩組(P＜0.001)，而完全培養(yǎng)基組的尿素水平高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基組(P＜0.001);三組培養(yǎng)基組的白蛋白分泌量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，但觀察白蛋白分泌量，三者較為接近，說明無血清培養(yǎng)基能維持較好的細(xì)胞功能。Real-timeqPCR顯示，無血清培養(yǎng)基組相對(duì)于完全培養(yǎng)基組，UGT、GST、AFP和ALB基因表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.640，0.075,0.504,1.000)，而CK18、CK19

10、和HNF4α基因表達(dá)量下降(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 研制了一種適合于肝細(xì)胞(C3A)生長(zhǎng)的無血清培養(yǎng)基，其與傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)在細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力以及細(xì)胞功能等方面能達(dá)到同樣的效果，為肝細(xì)胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分:四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細(xì)胞的比較研究
　　 目的:
　　 本研究通過四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞(C3A)的效果對(duì)比，找出最適合于肝

11、細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能最大發(fā)揮肝細(xì)胞功能的無血清培養(yǎng)基，為生物人工肝種子細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選和應(yīng)用以及生物人工肝走入臨床奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)按細(xì)胞培養(yǎng)基的不同分為6組:分別為A組:HepatoZYME-SFM培養(yǎng)基組;B組:William'sMediumE培養(yǎng)基組;C組:DMEM/F12培養(yǎng)基添加ITS、EGF、Nicotinamide、Asc2P、地塞米松、L-脯氨酸等組分;D組:自主研發(fā)無血清培養(yǎng)基;E組:完

12、全培養(yǎng)基（陽性對(duì)照組）;F組:基礎(chǔ)培養(yǎng)基（陰性對(duì)照組）:采取逐步降低血清濃度的方法培養(yǎng)C3A細(xì)胞，使細(xì)胞耐受培養(yǎng)基的改變以及適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng);細(xì)胞穩(wěn)定后，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和活力曲線觀察，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法檢測(cè)白蛋白分泌量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因水平的變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 六組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)曲線觀察，細(xì)胞在接種24小時(shí)后開始增

13、長(zhǎng)，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞數(shù)逐漸增多達(dá)到最大值后逐漸下降。A、B、C、D、F組，細(xì)胞生長(zhǎng)至第五天到達(dá)最大值，分別為(1.40±0.060)×106、(2.48±0.041)×106、(3.01±0.050)×106、(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后開始下降;而E組細(xì)胞生長(zhǎng)至第七天達(dá)到峰值，為(3.50±0.060)×106。C組細(xì)胞在培養(yǎng)初期生長(zhǎng)較快，細(xì)胞數(shù)明顯高于其他組(p＜0.001)，第四天開

14、始，E組的細(xì)胞密度超過C組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.000);A組的細(xì)胞密度由第三天開始明顯低于其他組(p＜0.001)，且一直保持較低水平，且一直保持較低水平;B、F兩組的細(xì)胞密度接近，處于中間水平;D組細(xì)胞除第六、七天外，與E組細(xì)胞密度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);細(xì)胞活力觀察，E組的細(xì)胞活力一直保持于最高水平，于培養(yǎng)的前三天明顯高于其他五組(p＜0.001)，由第五天開始，B、F組細(xì)胞活力無顯著性差異(p=0.910)而明顯低于

15、其他組(B與A、C、D、E組:p=0.005，0.007，0.000，0.001)，A組細(xì)胞活力處于中間水平;C、D兩組的細(xì)胞活力處于較高水平，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);細(xì)胞功能檢測(cè)，ALT漏出量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。F組的ALT漏出量由第三天開始明顯升高并顯著高于其余五組(P＜0.001)，最高達(dá)到(80.000±7.321)IU/L，細(xì)胞較早出現(xiàn)損傷;A組的ALT漏出量于第六天開始明顯升高，并顯著高于其余四組(P＜0.001)

16、，最高達(dá)到(53.167±2.483)IU/L;B、C、D、E組的ALT漏出量較為接近，一直保持于較低水平，;而尿素檢測(cè)結(jié)果顯示，D組的尿素分泌量除第一天低于E組(p=0.000)外一直處于最高水平，顯著高于其余5組(P＜0.001);E組的尿素分泌量于培養(yǎng)周期內(nèi)，明顯高于A、B、C、F四組(P＜0.001);C組的尿素分泌量明顯高于A、B、F三組(P＜0.001)，而低于D、E兩組(P＜0.001);A、B、F三組的尿素分泌量一直處于

17、較低水平;白蛋白結(jié)果顯示，D、E兩組的白蛋白的分泌量雖然有顯著性差異(P＜0.001)，但觀察兩組的分泌量，較為接近，且處于較高水平;A、C組的白蛋白分泌量較低;B組的白蛋白分泌量處于中間水平。熒光定量PCR結(jié)果顯示:UGT在各組(A、B、C、D、F)中的表達(dá)較完全培養(yǎng)基組（E組）都無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.774，0.866，0.197，0.877，0.293);GST、ALB的表達(dá)除A組(p=0.000，0.000)外，其余各組與完全培

18、養(yǎng)基組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);AFP的表達(dá)在A、B、C、D、E組基本相同(p＞0.05)，而F組顯著低于E組(p=0.041);A、D組的HNF4α表達(dá)量均低于完全培養(yǎng)基組(p=0.002，p=0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 本課題組研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的無血清培養(yǎng)基能通過各種機(jī)制在肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中有效地代替血清成分，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)、密度、活力、功能與含血清培養(yǎng)基基本相同，最適合于肝細(xì)胞(C3A)的