無血清培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與鑒定.pdf

1、目的：探討利用無血清培養(yǎng)基從原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中分離培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的可行性；觀察并比較膠質(zhì)瘤干細(xì)胞異種動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力。 方法：無菌條件下取腫瘤深部無壞死囊變、未電凝組織，剪切消化成單細(xì)胞懸液后，加入含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、B27添加劑的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，體外分離培養(yǎng)獲得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。待培養(yǎng)孔中細(xì)胞團(tuán)數(shù)量增多、培養(yǎng)液剛剛變色時(shí)，吸取含有細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)液進(jìn)行傳代。取第3代膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，加入巢蛋白和CD

2、133抗體行免疫熒光檢測(cè)；加入含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)5d，行膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫熒光染色觀察分化情況。將不同濃度膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于4w齡Balb/c裸鼠腋下，觀察腫瘤形成情況，接種6w后，將裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤取下，經(jīng)過固定、脫水、浸蠟、包埋后行HE染色。 結(jié)果： 1、原代培養(yǎng)7～10d可形成大小不一的細(xì)胞團(tuán)，球形或近似球形，呈懸浮或半懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)均一，折光性好；傳代2

3、4h后次代細(xì)胞團(tuán)形成，細(xì)胞的大小、形態(tài)與原代無明顯差別，連續(xù)傳代5次后細(xì)胞團(tuán)增殖活躍。 2、第3代膠質(zhì)瘤干細(xì)胞呈巢蛋白和CD133陽性表達(dá)， 3、加入胎牛血清后細(xì)胞球貼壁分化，呈膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性。 4、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)可形成膠質(zhì)瘤組織，移植瘤經(jīng)HE染色證明為膠質(zhì)瘤組織。 結(jié)論： 人腦膠質(zhì)瘤組織中存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，在體外無血清條件下可保持未分化的懸浮狀態(tài)；加入血清后貼壁分化呈膠質(zhì)瘤細(xì)胞