高血壓腦組織及血液中Klotho基因表達(dá)狀況的研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人民生活水平的提高，高血壓已成為危害人類健康的常見病、多發(fā)病。由于周身動(dòng)脈的強(qiáng)烈收縮，導(dǎo)致人體血壓升高，最終引起心、腦、腎等多個(gè)臟器功能障礙。高血壓所致的腦血管損害即是高血壓病的并發(fā)癥之一。盡管近年來關(guān)于高血壓腦損害的發(fā)生機(jī)制有了些突破性進(jìn)展。但迄今為止，其確切發(fā)病機(jī)制尚不明了。眾所周知，長期高血壓可引起全身小動(dòng)脈病變，表現(xiàn)為小動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞增殖和纖維化，管壁增厚和管腔狹窄，其一方面促使腦動(dòng)脈粥樣硬化和腦血栓形成，另一

2、方面，因血管腔狹窄，使腦血管發(fā)生缺血與變性，容易形成微動(dòng)脈瘤，從而發(fā)生腦出血。這些病理生理改變的最終結(jié)果是腦組織萎縮或功能退化，其過程酷似人類器官功能衰老退化的過程。 為了研究高血壓腦損害的發(fā)生機(jī)制并探討高血壓腦損害是否與衰老相關(guān)基因(Klotho基因)或某些危險(xiǎn)因素相關(guān)，本組研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究兩部分進(jìn)行。 第一部分(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))：Klotho基因在自發(fā)性高血壓模型鼠腦組織中的表達(dá)及藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn) 目的:以白

3、發(fā)性高血壓(SHR)模型鼠作為研究對(duì)象，觀察高血壓模型鼠腦組織損害的超微結(jié)構(gòu)變化和Klotho基因、微炎癥因子在腦組織中的表達(dá)狀況及用福辛普利(簡稱Fos)、纈沙坦(簡稱Val)與二者聯(lián)合干預(yù)后其腦組織中抗衰老基因Klotho基因和微炎癥因子細(xì)胞間粘附分子-1(簡稱ICAM-1)和血管細(xì)胞間粘附分子-1(簡稱VCAM-1)的表達(dá)變化，探討Klotho基因及微炎癥因子在高血壓腦損害中的作用與地位并探尋高血壓腦損害的早期有效治療方法。

4、 方法:20只雄性SHR鼠(22周齡)隨機(jī)分為4組：高血壓組(SHR組，蒸餾水灌胃)；Fos組(Fosinopril干預(yù)，以Fos10mg/kg/d灌胃)；Val組(Valsartan干預(yù)，以Val50mg/kg/d灌胃)；Fos+Val組，(Fosinopril與Valsartan聯(lián)合干預(yù)，以Fos10mg/kg/d+Val50mg/kg/d聯(lián)合灌胃)，每組5只。WKY組：5只Wistar-kyoto大鼠，作為正常對(duì)照組，蒸餾水灌胃

5、。各組大鼠自由進(jìn)食、飲水，共喂養(yǎng)8周至30周齡。實(shí)驗(yàn)過程中，①觀察藥物干預(yù)前、后SHR模型鼠高血壓和體重的變化；②用電鏡觀察高血壓腦損害時(shí)腦細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化及Fos、Val藥物干預(yù)對(duì)SHR模型鼠腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響；③用RT-PCR、Western bolt和免疫組織化學(xué)法分別檢測SHR模型鼠腦組織中Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并觀察Fos、Val干預(yù)實(shí)驗(yàn)后的表達(dá)變化。 結(jié)果:

6、 1.藥物干預(yù)對(duì)SHR模型鼠血壓、體重的影響藥物干預(yù)前，SHR組的大鼠血壓均明顯高于正常對(duì)照組(WKY組)；經(jīng)藥物Fos、Val以及兩者聯(lián)合干預(yù)8周后，大鼠血壓跟干預(yù)前比較明顯降低。藥物干預(yù)前、后5組間大鼠體重沒有明顯差異。提示藥物Fos、Val以及兩者聯(lián)合干預(yù)能降低SHR大鼠的血壓，抑制高血壓的進(jìn)程。 2.SHR模型鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化及藥物干預(yù)對(duì)其的影響藥物干預(yù)8周后，取藥物干預(yù)組和對(duì)照組大腦組織，電鏡檢測結(jié)果：

7、(1)WKY組：神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體豐富，結(jié)構(gòu)清晰，核大而圓，核膜清晰，核仁明顯，核染色質(zhì)淺淡。 (2)SHR組：約半數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞呈不同程度凋亡改變，表現(xiàn)為細(xì)胞固縮，染色質(zhì)邊集，核開始碎裂，凋亡小體形成。 (3)Fos組：少數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，絕大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。 (4)VAL組：部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、扭曲、碎裂，有部分神經(jīng)元扭曲變形，早期凋亡小體開

8、始。 (5)Fos+Val組：大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞趨于正常，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體結(jié)構(gòu)清晰，亦有少數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，核開始碎裂。凋亡改變組間比較發(fā)現(xiàn)：由多到少排列：SHR組→Val組→Fos組→Fos+Val組→正常組(WKY組)。提示高血壓可損害腦神經(jīng)元細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，經(jīng)Fos、Val以及兩藥聯(lián)合干預(yù)后，其神經(jīng)元損害有不同程度的恢復(fù)或減緩，證明Fos、Val具有保護(hù)腦細(xì)胞功能的作用。 3.Klotho基因、

9、ICAM-1和VCAM-1在自發(fā)性高血壓大鼠腦組織中的表達(dá)及藥物干預(yù)作用 (1)RT-PCR和Western blot檢測SHR鼠腦組織藥物干預(yù)前后Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化A.Klotho基因表達(dá)變化情況：①與正常對(duì)照組相比，SHR組腦組織Klotho基因表達(dá)明顯下調(diào)；②藥物干預(yù)8周后，F(xiàn)os組、Val組和Fos與Val聯(lián)合干預(yù)組的Klotho基因的表達(dá)與正常對(duì)照(WKY)組比較

10、無明顯差異，而與SHR組比較顯著上調(diào)。B.ICAM-1和VCAM-1mRNA表達(dá)變化情況：①SHR組腦組織ICAM-1和VCAM-1mRNA表達(dá)與正常對(duì)照(WKY)組比明顯上調(diào)；②藥物干預(yù)8周后，F(xiàn)os組、Val組和Fos與Val聯(lián)合干預(yù)組ICAM-1和VCAM-1mRNA的表達(dá)與正常對(duì)照(WKY)組相比沒有明顯的差異，與自發(fā)性高血壓(SHR組)比較存在明顯的差異。結(jié)果表明：SHR組腦組織ICAM-1和VCAM-1 mRNA處于高表達(dá)狀

11、況，而用Fos、Val或Fos與Val聯(lián)合干預(yù)可以使SHR模型鼠腦組織的ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)。 (2)免疫組織化學(xué)法檢測SHR組腦組織藥物干預(yù)前后Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1在蛋白水平的表達(dá)變化A.Klotho蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿中。 小結(jié): 1.高血壓可導(dǎo)致腦組織損害； 2.高血壓腦損害時(shí)腦組織Klotho基因處于低表達(dá)水平，而微炎癥因子ICAM-

12、1、VCAM-1呈現(xiàn)高表達(dá)； 3.Fos或/和Val除了有效降壓，同時(shí)還能通過調(diào)控Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1表達(dá)狀況來保護(hù)細(xì)胞功能； 4.高血壓腦損傷有炎癥因子參與，且可能與抗衰老基因Klotho基因有一定的關(guān)系； 5.使用福辛普利或纈沙坦可能有利于早期防治高血壓腦損害。 第二部分(臨床研究)：高血壓腦損害患者血清Klotho蛋白水平測定及相關(guān)危險(xiǎn)因素分析 目的:在本組研究的動(dòng)物

13、實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，擬從臨床研究角度檢測高血壓腦損害患者血漿Klotho蛋白水平的變化，并針對(duì)高血壓發(fā)生的相關(guān)危險(xiǎn)因素(包括年齡、血壓、血糖、膽固醇及高血壓病史)進(jìn)行綜合分析，旨在進(jìn)一步探討高血壓腦損害的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)的危險(xiǎn)因素，為今后高血壓腦損害的早期防治提供依據(jù)。 方法: 以湘雅醫(yī)院2007年9月-2008年3月門急診患者為研究對(duì)象(確診的未出現(xiàn)并發(fā)癥的高血壓患者56例，高血壓腦損害患者104例)，以正常血壓人群30例作

14、對(duì)照，檢測三組研究對(duì)象血清Klotho蛋白濃度與血清膽固醇、肌酐、血糖、血壓水平并針對(duì)以上因素及年齡和高血壓病史等危險(xiǎn)因素進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果: 正常對(duì)照組血清Klotho蛋白濃度明顯高于高血壓(無腦損害)組與高血壓腦損害組(p<0.05)，同時(shí)高血壓(無腦損害)組明顯高于高血壓腦損害組。血清Klotho蛋白濃度與高血壓及高血壓腦損害患者的膽固醇、肌酐、血糖、血壓、年齡以及高血壓病史等均存在負(fù)相關(guān)。 小結(jié):

15、 1.血清Klotho蛋白濃度隨血壓升高的程度而呈逐漸下降的趨勢； 2.血清Klotho蛋白濃度與高血壓及高血壓腦損害患者的膽固醇、肌酐、血糖、血壓、年齡以及高血壓病史等均存在負(fù)相關(guān)，膽固醇、肌酐、血糖、血壓等越高、年齡越大以及高血壓病史等越長，血清Klotho蛋白濃度越低； 3.血清Klotho蛋白濃度增加可能是高血壓及高血壓腦損害的保護(hù)性因素； 4.高血壓患者定期檢測血清Klotho蛋白濃度可能有助于早期

16、監(jiān)測高血壓腦損害。 結(jié)論: 1.SHR模型鼠在血壓升高的同時(shí)存在腦組織損害，即電鏡中可觀察到的高血壓模型鼠腦組織凋亡小體的形成； 2.SHR模型鼠腦組織有ICAM與VCAM的mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)，證明高血壓腦損害時(shí)存在血管炎癥改變； 3.SHR模型鼠在炎癥改變同時(shí)，其腦組織Klotho基因表達(dá)下調(diào)，說明高血壓腦損害可能與衰老過程有關(guān)； 4.福辛普利和纈沙坦干預(yù)實(shí)驗(yàn)后，腦組織炎癥改變(ICA

17、M-1、VCAM-1 mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào))好轉(zhuǎn)同時(shí)Kloth基因表達(dá)上調(diào)。提示福辛普利和纈沙坦對(duì)高血壓腦組織的保護(hù)除了降壓作用外，可能還與改變Klotho基因表達(dá)有關(guān)； 5.臨床研究結(jié)果表明，高血壓患者血清Klotho蛋白水平較正常人低，且與膽固醇、肌酐、血糖、血壓、年齡以及高血壓病史等均存在負(fù)相關(guān)，膽固醇、肌酐、血糖、血壓等越高、年齡越大以及高血壓病史等越長，血清Klotho濃度越低，提示高血壓患者定期檢測血清Klo