Klotho基因在高血壓腎損害腎小管上皮細胞凋亡中的作用及冬蟲夏草對其的影響.pdf

1、高血壓病致腎損害的發(fā)病率逐年上升，已成為終末期腎臟疾?。‥ndStageRenalDisease，ESRD）的主要原因之一。以往對高血壓腎損害的研究主要集中在腎小球，近年來認為腎小管間質(zhì)損害程度比腎小球損害程度更能反映慢性腎功能衰竭的進展及預(yù)后，而腎小管上皮細胞凋亡在腎小管間質(zhì)病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 Klotho基因是新發(fā)現(xiàn)的與人類衰老相關(guān)的基因，主要表達于腎臟和大腦脈絡(luò)膜中，尤以腎小管上皮細胞表達明顯。Klotho基因缺

2、陷小鼠可表現(xiàn)出一系列類似人類衰老的表型，慢性腎功能衰竭患者常出現(xiàn)以上許多類似表現(xiàn)。近年來已有學(xué)者在5/6腎切除大鼠、急性腎衰竭大鼠、ICR衍生性腎小球腎炎小鼠、腎臟上皮細胞癌、慢性腎功能衰竭及其鈣磷代謝紊亂等研究中對Klotho基因在相關(guān)腎臟疾病發(fā)病機制中的作用進行了探討。但目前尚缺乏Klotho基因與高血壓腎損害的相關(guān)研究。 冬蟲夏草（cordycepssinensis，CS）是我國傳統(tǒng)中藥中的瑰寶，具有良好的腎保護作用，但其

3、作用機制尚不清楚。本研究擬采用血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）干預(yù)的大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）和自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneouslyhypertensiverat，SHR）作為研究對象，用冬蟲夏草和血管緊張素Ⅰ型受體拮抗劑--氯沙坦（Losartan，Los）分別對其進行干預(yù)，觀察Klotho基因及凋亡相關(guān)基因p53、p21等的表達和腎小管上皮細胞的凋亡情況，探討Klotho在高血壓腎損害腎小管上皮細

4、胞凋亡中的作用及冬蟲夏草腎臟保護作用的可能機制。 第一章血管緊張素Ⅱ?qū)RK-52E中Klotho表達和凋亡的影響及冬蟲夏草對其的干預(yù)作用 目的：研究AngⅡ干預(yù)NRK-52E后Klotho、p53和p21的表達和細胞凋亡情況以及冬蟲夏草提取液對其的影響，探討冬蟲夏草對AngⅡ誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響及機制。 方法 1.NRK-52E按AngⅡ濃度梯度0（對照組），10-10，10-9，10-8，1

5、0-7，10-6mol/L分6組培養(yǎng)24小時，選擇最佳的AngⅡ干預(yù)濃度后按時間梯度0（對照組），6，12，18，24小時分5組培養(yǎng)，確定最佳干預(yù)時間。冬蟲夏草提取液按濃度梯度0（對照組），5，10，20，40，80mg/L單獨或與AngⅡ共同培養(yǎng)NRK-52E24，48，72小時，確定其最佳干預(yù)濃度及干預(yù)時間。采用MTT比色法檢測細胞增殖；逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測KlothomRNA表達；分光光度法檢測caspase-

6、3的活性；AnnexinV-PI雙染法及流式細胞儀檢測細胞凋亡。 2.根據(jù)上述實驗結(jié)果選擇AngⅡ（10-8mol/L）及冬蟲夏草提取液（40mg/L）的最佳干預(yù)濃度培養(yǎng)NRK-52E24小時，以氯沙坦（10-5mol/L）作為陽性對照藥物。設(shè)立對照組，AngⅡ組，AngⅡ+CS組，AngⅡ+Los組和AngⅡ+CS+Los組。分別采用RT-PCR及WesternBlot檢測Klotho、p53、p21mRNA及蛋白表達；分光光

7、度法檢測caspase-3的活性；AnnexinV-PI雙染法及流式細胞儀檢測細胞凋亡。 結(jié)果： 1.AngⅡ（10-9mol/L～10-6mol/L）可顯著下調(diào)NRK-52E中KlothomRNA的表達（P<0.01）；隨著AngⅡ濃度增加（10-10mol/L～10-6mol/L）及干預(yù)時間延長（6h～24h），NRK-52E細胞caspase-3活性逐漸增高，細胞凋亡率逐漸增加（P<0.01）。 2.冬蟲夏

8、草提取液（5mg/L～80mg/L）單獨對NRK-52E中KlothomRNA表達無明顯影響（P>0.05）；冬蟲夏草提取液（5mg/L～40mg/L）可拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的Klotho基因低表達，濃度越高，其作用越明顯（P<0.05或P<0.01）；與AngⅡ組比較，隨著冬蟲夏草提取液干預(yù)濃度增加（10mg/L～40mg/L），NRK-52E細胞增殖逐漸增加，caspase-3活性及細胞凋亡率逐漸降低（P<0.01）。 3.An

9、gⅡ組KlothomRNA及蛋白表達明顯下調(diào)，p53及p21表達上調(diào)，caspase-3活性增高，細胞凋亡率增加（P<0.01）；經(jīng)冬蟲夏草或/和氯沙坦干預(yù)后，KlothomRNA及蛋白表達上調(diào)，p53和p21表達下調(diào)，caspase-3活性及細胞凋亡率降低（P<0.05或P<0.01）。聯(lián)合用藥組較單用藥組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 第二章自發(fā)性高血壓模型鼠腎臟Klotho的表達和腎小管上皮細胞凋亡情況及冬蟲夏草對

10、其的干預(yù)作用 目的：觀察自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎臟Klotho的表達和腎小管上皮細胞凋亡情況以及冬蟲夏草對其的影響，探討Klotho基因在高血壓腎損害腎小管上皮細胞凋亡中的作用，以及冬蟲夏草腎保護作用的相關(guān)機制。 方法：20只22周齡雄性SHR隨機分為4組（5只/組）：高血壓模型組（SHR組），冬蟲夏草組（CS組，CS5g/kg/d灌胃），氯沙坦組（Los組，Los50mg/kg/d灌胃），冬蟲夏草＋氯沙坦組（CS+

11、Los組，CS5g/kg/d+Los50mg/kg/d聯(lián)合灌胃）；22周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠（WKY組）6只作為對照組，共喂養(yǎng)8周。檢測各組大鼠體重、尾動脈收縮壓、24小時尿蛋白定量（Upro）、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG酶）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）。采用HE及Masson染色方法觀察腎臟病理改變；原位缺口末端標記法（TUNEL法）檢測腎小管上皮細胞凋亡；免疫組織化學(xué)法檢測Klotho蛋白表達

12、；RT-PCR檢測Klotho、p53和p21mRNA表達；WesternBlot檢測Klotho、p53、p21和活性caspase-3蛋白表達。 結(jié)果： 1.實驗第8周（30周齡），SHR組大鼠的收縮壓、Upro、尿NAG酶、BUN和Scr均明顯高于WKY組，并出現(xiàn)腎臟小動脈管壁增厚及玻璃樣變，腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，腎小管間質(zhì)炎性細胞浸潤，部分腎小球毛細血管缺血性皺縮、硬化等高血壓腎損害的病理特征；經(jīng)冬蟲夏草

13、或/和氯沙坦干預(yù)后，SHR的Upro、尿NAG酶、BUN和Scr均較未干預(yù)組降低，高血壓引起的腎臟病理損害減輕（P<0.05或P<0.01）；冬蟲夏草對血壓變化無明顯影響（P>0.05）。 2.Klotho蛋白主要表達于腎小管上皮細胞胞漿及胞核中，且以遠曲小管上皮細胞為主。SHR組大鼠腎臟KlothomRNA及蛋白表達較WKY組明顯下調(diào)，同時p53和p21表達上調(diào)，活性caspase-3蛋白表達上調(diào)，腎小管上皮細胞凋亡率增加（1

14、3.316％±0.645％vs0.810％±0.115％，P<0.01）；經(jīng)冬蟲夏草或/和氯沙坦干預(yù)后，KlothomRNA及蛋白表達上調(diào)，p53、p21和活性caspase-3表達下調(diào)，腎小管上皮細胞凋亡率降低（分別下降為7.559％±0.520％、7.928％±0.370％和7.373％±0.363％，P<0.01）。而各干預(yù)組間以上各項觀察指標的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論： 1.AngⅡ可使NRK-5

15、2E中Klotho基因的表達下調(diào)，同時使p53和p21的表達上調(diào)，活化caspase-3，從而誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡過程，這可能是其在高血壓腎損害腎小管細胞凋亡中的作用機制之一。 2.冬蟲夏草提取液可拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡，其抗凋亡作用可能與增加腎小管上皮細胞Klotho基因的表達，抑制p53/p21凋亡通路和caspase-3的激活有關(guān)。 3.SHR模型鼠出現(xiàn)腎間質(zhì)損傷的同時，腎臟Klotho基因的表達明