Fgfr2 S252W功能增強型突變對小鼠下頜骨及牙齒影響研究.pdf

1、研究背景：
　　依據(jù)序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育的不同,成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactors,FGFs)及其受體成纖維細胞生長因子受體(fibroblastgrowthfactorreceptors,FGFRs)家庭分別有22個FGF成員和5個FGFR成員。成纖維細胞生長因子和成纖維細胞生長因子受體結合所構成的FGFs/FGFRs信號傳遞是胚胎發(fā)育、血管新生、骨骼形成、腫瘤形成及傷口愈合、纖維化的重要原因之一

2、。FGFRs是一個多基因家族,屬免疫球蛋白基因超家族成員,均為酪氨酸激酶受體,在細胞的增殖、分化、血管生成、骨骼發(fā)育及生長和發(fā)育相關的進程中起著十分重要的作用。其中FGFR2的突變可引起一系列疾病,其外顯子Ⅲa突變可引起Apert綜合癥(Apert Syndrome,AS),一種常見的人類多顱縫早閉所致的綜合征,主要由兩種Fgfr2功能增強型突變,即Fgfr2Ser252Trp(S252W)或者Pro253Arg(P253R)突變引起。

3、Fgfr2S252W突變患者主要表現(xiàn)出嚴重的顱面部骨骼畸形,包括突眼和中面部嚴重發(fā)育不良,口腔臨床表現(xiàn)為腭蓋高拱,部分患者伴有腭裂,牙列擁擠和開牙合、錯牙合畸形,遲萌,異位萌出,鏟型切牙,額外牙,牙槽嵴膨隆,滯生牙,局部萌出等,給患者帶來嚴重的生理缺陷及心理障礙,因此,尋求最佳模擬Apert綜合征的模式動物進行研究刻不容緩。
　　目前,多數(shù)研究集中于S252W突變引起的頭顱和長骨及其信號通路的異常,然而,僅有少量報道研究下頜骨的改

4、變。杜等利用EDMA定量比較了突變小鼠和對照小鼠下頜骨的形態(tài)和發(fā)育變化,發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長,突變體下頜骨的縮短變得越來越嚴重。然而,下頜骨的發(fā)育是一個連續(xù)的、動態(tài)的過程,先前研究只是集中于突變體下頜骨解剖形態(tài)的改變,少有資料研究FGFR2S252W突變小鼠下頜骨微結構改變與年齡相關的動態(tài)變化。本課題利用基因敲入技術建立Fgfr2功能增強型突變小鼠進行研究。觀察分析Fgfr2S252W突變小鼠骨骼表型的變化,探討該小鼠作為Apert綜合征

5、小鼠模型的可行性。同時利用多種技術手段,從整體動物水平和組織蛋白等水平多層次、多角度地分析Fgfr2S252W功能改變對小鼠下頜骨微結構及牙齒結構的影響,初步探討Apert綜合征發(fā)病的遺傳機制,為尋找相應臨床治療措施提供一定的實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　第一部分，F(xiàn)gfr2S252W功能增強型突變對小鼠下頜骨影響研究
　　1.Fgfr2S252W模式動物的繁殖、鑒定與分組:將雌性帶neo基因+突變Fgfr2的基因

6、工程小鼠和雄性EIIa-Cre小鼠交配,在子代中獲得約1/4數(shù)量的Fgfr2S252W功能增強型突變小鼠。在納入實驗前,提取胎鼠或新生小鼠腳趾DNA作PCR基因型鑒定,提取肝臟總蛋白作Fgfr2蛋白表達測定,按照基因型分為野生型對照組(+/+)和突變型(S252W/+)兩組進行相關實驗研究。
　　2.突變/對照小鼠體質量、鼻-肛門長度、下頜骨鈣磷含量測定及阿爾辛藍-茜素紅骨架染色判斷突變小鼠骨量變化。測定血清鈣磷含量,了解體內鈣磷

7、代謝是否與骨骼礦化有關。
　　3.為研究FGFR2S252W小鼠下頜骨骨量變化時骨骼微結構有無改變,實驗利用H&E染色及MicroCT從二維及三維角度對P28和P56齡小鼠骨松質和骨皮質微結構進行了分析。
　　4.通過鈣黃綠素熒光雙標檢測下頜骨礦化沉積率,甲苯胺藍染色檢測成骨細胞數(shù)量,TRAP染色檢測下頜骨破骨細胞數(shù)量。
　　5.通過免疫熒光技術檢測Erk1/2通路在Fgfr2S252W突變小鼠下頜骨生長障礙中的表達變

8、化。
　　第二部分，F(xiàn)gfr2S252W功能增強型增強對小鼠下頜牙齒影響研究
　　1.Fgfr2S252W模式動物的繁殖、鑒定與分組:同第一部分。
　　2.突變/對照小鼠下頜切牙的口外觀察及離體對比觀察,下頜切牙。下頜切牙和第一磨牙形態(tài)學Micro-CT測量。第一磨牙H&E染色觀察成釉細胞、成牙本質細胞的變化。
　　3.鈣黃綠素熒光雙標檢測突變/對照小鼠牙齒礦化沉積率。
　　4.E13.5(蕾狀期)、E15

9、.5(帽狀期)、E18.5(鐘狀期)天胎鼠突變組和野生對照組乳鼠下頜切牙、第一磨牙形態(tài)觀察。
　　5.突變/對照小鼠下頜第一磨牙牙囊組織及牙乳頭組織中p-ERK1/2表達差異比較。
　　主要結果:
　　一、Fgfr2S252W突變致小鼠下頜骨骨量減少,微結構改變
　　1.Fgfr2S252W功能增強型突變小鼠具有類似人類Apert綜合征的典型骨骼表型。包括冠狀縫、PF縫早閉,圓顱和短顱畸形、中臉發(fā)育不良,下頜切牙

10、伸長、反牙合等。
　　2.從P7到第P56,每周測量突變小鼠和對照小鼠的體質量和鼻-肛門長度,均存在顯著差異,且隨著時間的延長,差異越來越明顯,全骨架染色顯示突變小鼠整體骨架縮小。P28和P56,鈣磷含量在突變小鼠和對照小鼠血清中無差異,突變體體內鈣磷代謝水平正常,提示Fgfr2S252W突變沒有影響體內鈣磷代謝。但鈣磷含量在下頜骨中差異顯著,提示FGFR2功能增強型點突變可能是直接影響了骨礦化,且與年齡無關。
　　3.在P

11、28和P56,突變小鼠礦化沉積率MAR均降低,甲苯胺藍染色陽性的成骨細胞數(shù)量占骨表面的百分比(ob.s/BS)(％)均降低,TRAP染色陽性的破骨細胞數(shù)量在單位骨面積上含量均增多。提示FGFR2S252W突變可能導致了成骨細胞數(shù)量減少或功能降低,破骨細胞數(shù)量增多,且與年齡無關。
　　4.下頜骨MicroCT定量的三維結構參數(shù)是對H&E二維染色結果的進一步驗證,結果顯示:在P28和P56,突變小鼠與對照小鼠比較,其骨松質的BV/TV

12、、Tb.Th、Conn.D及DA均下降,Tb.N,Tb.Sp和SMI分別顯著增加,骨皮質中BV/TV和C.Th降低,SMI升高,突變小鼠下頜骨結構的改變與年齡無關。
　　5.采用免疫熒光技術研究磷酸化的Erk1/2在突變小鼠下頜骨骨組織中改變情況。結果顯示,提高放大倍數(shù)后光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),突變小鼠下頜骨骨細胞中熒光信號增強,Erk1/2在突變小鼠骨組織中被激活。
　　二、Fgfr2S252W突變致小鼠下頜切牙及第一磨牙異常

13、
　　1.突變組小鼠下頜切牙、第一磨牙冠長及冠根比較對照組增加。
　　2.突變小鼠切牙礦化生長速率MRA明顯高于對照小鼠。
　　3.下頜切牙H&E染色顯示Fgfr2S252W突變致成釉細胞、成牙本質細胞形態(tài)改變及數(shù)量增加,頸環(huán)縮小,上皮隔皺縮。第一磨牙H&E染色顯示成釉細胞數(shù)量增加,成牙本質細胞無明顯改變。
　　4.對照小鼠下頜切牙成釉器E13.5(蕾狀期)、E15.5(帽狀期)、E18.5(鐘狀期)的發(fā)育均稍滯

14、后于同時期突變小鼠牙胚的發(fā)育。同樣現(xiàn)象出現(xiàn)在第一磨牙成釉器的各個發(fā)育時期。
　　5.WB檢測Fgfr2S252W功能增強型突變小鼠的牙囊組織、牙乳頭組織中p-Erk1/2表達均增強。
　　主要結論:
　　1.通過基因敲入技術建立的Fgfr2S252W突變小鼠具有Apert綜合征患者典型的顱面畸形,有望成為研究Apert綜合征下頜骨及牙齒異常機制的良好模式動物模型。
　　2.Fgfr2S252W功能增強型點突變導致

15、小鼠下頜骨骨量下降及微結構的改變,且與年齡無關。
　　3.Fgfr2S252W功能增強型點突變小鼠下頜骨骨量的下降可能由其成骨細胞及破骨細胞功能及數(shù)量改變共同引起。
　　4.FGFR2功能增強后可能通過激活牙囊組織、牙乳頭組織中Erk1/2信號通路導致突變小鼠下頜牙齒生長發(fā)育異常。
　　綜上所述:
　　本課題的研究結果表明建立的Fgfr2S252W突變小鼠是研究Apert綜合征的良好模式動物模型之一。本課題提示F