冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復灌損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、第一部分:冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復灌損傷的保護作用及機制研究
　　 目的：研究冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復灌損傷的保護作用并探討其作用機制。
　　 方法：采用出生后6-8周健康成年雄性昆明種小鼠，隨機分為4組(每組8只)：假手術組、模型組、冬蟲夏草素低劑量組（10mg/kg）、冬蟲夏草素高劑量組（20mg/kg）。冬蟲夏草素組小鼠灌胃給藥(0.1ml/10g體重），假手術組、模型組小鼠灌胃給雙蒸水（0.1ml/10g體重），

2、每天灌胃一次，連續(xù)給藥七天后，小鼠用10％水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉后行雙側頸總動脈結扎，缺血15分鐘后復灌4小時，建立缺血復灌損傷模型。
　　 結果：
　　 1．冬蟲夏草素對小鼠缺血復灌損傷后大腦皮層以及海馬神經細胞的形態(tài)學影響：
　　 小鼠雙側頸總動脈結扎（2VO）缺血15分鐘復灌4小時后,可見模型組小鼠大腦皮層以及海馬CA1區(qū)神經細胞明顯損傷，如細胞核濃縮、核碎裂、核消失、細胞深染等現象，正常神經

3、細胞數目顯著減少（與假手術組相比p<0.01，n=5）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預處理后則明顯減輕大腦皮層以及海馬CA1區(qū)神經細胞損傷狀況，神經細胞丟失數目顯著減少（與模型組相比p<0.05，n=5）。
　　 2．冬蟲夏草素對小鼠缺血復灌損傷后大腦脂質過氧化程度的影響：
　　 假手術組SOD活力、MDA水平分別為93.54±12.94 (U/mg．Protein)（n=8）、1.83±0.44 (nM/mg．Prot

4、ein)（n=8）。缺血15分鐘復灌4小時后，腦組織內SOD活力降低 48.5％ （與假手術組相比p<0.01，n=8）。MDA水平升高65.9％（與假手術組相比p<0.01，n=8）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預處理后則明顯減輕大腦脂質過氧化程度，腦組織內SOD活力明顯升高（與模型組相比p<0.05，n=8）。MDA水平明顯降低（與模型組相比p<0.05，n=8）。
　　 3．冬蟲夏草素對小鼠缺血復灌損傷后腦內氨基酸神經遞質

5、的影響:
　　 缺血15分鐘復灌4小時后,小鼠大腦內五種氨基酸的含量明顯增加,增加比例如下:天冬氨酸(144％)，谷氨酸(117％),甘氨酸(328％),牛磺酸(121％)，γ氨基丁酸(86％)（與假手術組相比p<0.05，n=8）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預處理后則明顯減少大腦內五種氨基酸的含量。降低比例如下：天冬氨酸(39％)、谷氨酸(28％),甘氨酸(60％),?；撬?23％)，γ氨基丁酸(36％)（與模型組相比p<0

6、.05，n=8）。
　　 4．冬蟲夏草素對小鼠缺血復灌損傷后腦內基質金屬蛋白酶3的影響：
　　 小鼠腦缺血15分鐘復灌4小時后，腦組織內基質金屬蛋白酶-3表達增加191.5％ （與假手術組相比p<0.01，n=8）。冬蟲夏草素（10mg/kg）預處理后則明顯減少大腦基質金屬蛋白酶-3表達，降低45.8％（與模型組相比p<0.05，n=8）。
　　 5．冬蟲夏草素對小鼠缺血復灌損傷后大腦皮層及海馬各區(qū)NF-КB表達

7、的影響：
　　 各組小鼠CA1區(qū)IKKα（IКB-kinase-α）的熒光密度（均值±標準差）：假手術組67.66±8.72；模型組117.08±21.41；冬蟲夏草素（10mg/kg）組為89.58±11.32；各組小鼠CA1區(qū)P65（是NF-КB的一種主要亞基，也稱為RelA）的熒光密度（均值±標準差）：假手術組63.53±8.94；模型組164.72±19.03；給藥組118.29±11.76。經SPSS13.0軟件統(tǒng)計處

8、理，模型組與假手術組熒光密度相比有極顯著性差異（P<0.01）; 冬蟲夏草素（10mg/kg）組與模型組熒光密度相比有顯著性差異（P<0.05）。
　　 結論：
　　 1．冬蟲夏草素（10mg/kg）對小鼠腦缺血復灌損傷具有明顯的保護作用，其作用可能與降低腦缺血復灌后脂質過氧化程度，減少細胞外谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸含量，以及抑制細胞內基質金屬蛋白酶-3的激活有關。2．冬蟲夏草素在較高劑量組（20mg/kg）對小鼠

9、腦缺血再灌注損傷的保護作用不明顯，其機制有待進一步研究。
　　 第二部分、冬蟲夏草素對小鼠全腦腦片氧糖剝奪復氧損傷的保護作用及機制研究
　　 目的：研究冬蟲夏草素對小鼠腦缺血復灌損傷的保護作用并探討其作用機制。
　　 方法：出生后(6-8周)健康成年雄性小鼠隨機分為5組(每組8只)：正常組、OGD模型組、冬蟲夏草素組(20μМ、40μМ、80μМ），各組小鼠經10％水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉斷頭后取腦，

10、使用振蕩切片機制備腦片，厚400μm，置于持續(xù)通95％O2和5％CO2混合氣體的人工腦脊液（ACSF）中，在室溫條件下孵育30分鐘,以恢復腦片活性，再置于37℃恒溫水浴箱中孵育30分鐘后，更換無糖人工腦脊液，并通95％ N2和5％CO2混合氣體，進行氧糖剝奪損傷15分鐘（正常組除外），然后重新更換人工腦脊液，通入95％O2和5％CO2混合氣體孵育240分鐘，建立腦片氧糖剝奪復氧損傷模型。用TTC染色和PI染色方法觀察腦片損傷程度。將腦片

11、孵育液收集，試劑盒檢測LDH含量；高效液相色譜法（HPLC）檢測孵育液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、?；撬?、γ氨基丁酸的含量；ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-10的含量。將腦片組織收集并提取蛋白，用Western-blot方法檢測NF-КB通路的IKKα、P65和MAPK通路P-ERK（1/2）的表達。
　　 結果：
　　 1.冬蟲夏草素對氧糖剝奪復氧損傷后小鼠腦片活性的影響：
　　 TTC染色結果、PI染色

12、結果、孵育液中LDH檢測結果顯示在氧糖剝奪15分鐘復氧4小時后，與正常組比較，模型組腦片損傷明顯加重，而冬蟲夏草素20μМ和40μМ處理組能顯著減輕損傷。冬蟲夏草素80μМ減輕損傷的作用不明顯。
　　 2.冬蟲夏草素對腦片氧糖剝奪復氧損傷后炎癥細胞因子釋放的影響。
　　 ELISA 檢測結果反映在腦片氧糖剝奪復氧損傷后，模型組中兩種細胞因子IL-1β和IL-10含量均有顯著增加。冬蟲夏草素20μМ、40μМ、80μМ處理

13、組均能顯著降低炎癥因子IL-1β分泌量，而40μМ能顯著增加IL-10分泌量。
　　 3.冬蟲夏草素對腦片氧糖剝奪復氧損傷后氨基酸神經遞質釋放的影響：
　　 HPLC檢測結果顯示在腦片氧糖剝奪復氧損傷后，模型組孵育液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、?；撬?、γ氨基丁酸均顯著升高，冬蟲夏草素20μМ、40μМ處理組能明顯降低谷氨酸和天冬氨酸的水平，20μМ組能明顯升高牛磺酸的水平。冬蟲夏草素各處理組對于甘氨酸和γ氨基丁酸水平則有

14、不同程度的降低。
　　 4.冬蟲夏草素對腦片氧糖剝奪復氧損傷后腦組織內NF-КB通路和MAPK之 ERK（1/2）通路的影響：
　　 Western-blot實驗證實在腦片氧糖剝奪復氧損傷后，與正常組相比較，模型組腦組織內IKKα、P65、P-ERK（1/2）的表達均顯著增加，冬蟲夏草素20μМ、40μМ、80μМ處理組能明顯降低IKKα、P65的表達，冬蟲夏草素20μМ、40μМ處理組能明顯降低P-ERK（1/2）的表

15、達。
　　 結論：
　　 1.氧糖剝奪15分鐘復氧4小時能引起腦片組織明顯的損傷，孵育液中興奮性和抑制性氨基酸含量均顯著增加，炎癥因子IL-1β、IL-10均顯著增加，腦片組織內IKKα、P65、P-ERK（1/2）的表達均顯著增加。
　　 2.冬蟲夏草素對氧糖剝奪復氧損傷有較好的保護作用，其作用機制可能與降低腦片復氧損傷后細胞外液中谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸含量，調節(jié)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸平衡有關系