球狀脂聯(lián)素對(duì)糖尿病小鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用及其抗凋亡機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病(Diabetes millitus,DM)是一種復(fù)雜的代謝性疾病,且目前在我國(guó)已成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題,調(diào)查顯示其標(biāo)準(zhǔn)化年齡的患病率為9.7％。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生腦卒中的幾率較正常人增加1.5至3倍,也使卒中的復(fù)發(fā)率增加1倍,同時(shí)糖尿病可增加中風(fēng)患者的死亡率和致殘率。因此如何治療糖尿病合并腦卒中成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是主要由脂肪細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞因子,血漿含量較高。APN

2、主要功能片段位于C末端的球狀區(qū)域,即所謂的球狀脂聯(lián)素(globular adiponectin,gAD)。APN具有多種生物學(xué)功能如調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、抗凋亡等作用。動(dòng)物研究表明,APN可減少DM小鼠心肌缺血-再灌注損傷,但APN對(duì)DM小鼠腦缺血-再灌注損傷作用,目前尚未知。
　　本課題擬線栓法建立小鼠 MCAO(大腦中動(dòng)脈阻塞)模型,通過(guò) STZ(streptozotocin)腹腔注射誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病(type1 diabetes

3、,T1DM)模型,觀察gAD對(duì)正常小鼠腦缺血再灌注的保護(hù)作用及其機(jī)制,并進(jìn)一步研究gAD對(duì)Ⅰ型糖尿病小鼠的腦保護(hù)作用,從而為臨床治療缺血性腦卒中及糖尿病合并腦卒中患者提供可靠的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分:球狀脂聯(lián)素對(duì)正常小鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用及其抗凋亡機(jī)制的研究
　　目的:近來(lái)有研究表明脂聯(lián)素可減少腦缺血損傷。脂聯(lián)素的主要功能片段位于C末端的球狀區(qū)域,即所謂的球狀脂聯(lián)素(globular adiponectin,g

4、AD),但有關(guān)其保護(hù)機(jī)制目前尚未清楚。氧化應(yīng)激損傷在缺血-再灌注損傷中重要的機(jī)制之一,NADPH氧化酶2(NADPH oxidase2, NOX2)是體內(nèi)ROS(氧自由基)的主要來(lái)源,因此本實(shí)驗(yàn)的目的:
　　1、研究gAD對(duì)腦缺血損傷的作用及其抗氧化的影響
　　2、研究NOX2是否參與gAD的抗氧化和抗凋亡作用
　　方法:
　　1、gAD腦保護(hù)作用及其對(duì)抗氧化的影響
　　成年雄性C57BL/6小鼠行MCAO

5、模型誘導(dǎo)腦缺血。隨機(jī)分為Sham組;MCAO組,缺血90 min后再灌注24h;gAD組,缺血前30min行側(cè)腦室注射gAD;Vehicle組,溶劑組,即缺血前30 min側(cè)腦室注射同等體積的PBS。于再灌注24h后行行為學(xué)評(píng)分;腦梗死容積分析;抗氧化物酶 SOD,catalase活性測(cè)定,MDA含量測(cè)定;TUNEL染色及凋亡陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù);及凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax和活化caspase3的測(cè)定;同時(shí)采用western blot的方法

6、觀察NOX2的改變。
　　2、NOX2激動(dòng)劑對(duì)gAD腦保護(hù)及抗氧化能力的影響
　　成年雄性C57BL/6小鼠行MCAO模型誘導(dǎo)腦缺血。隨機(jī)分為MCAO組,缺血組,同前;gAD組,同前;gAD+TBCA(tetrabromocinnamic acid, TBCA,NOX2的激動(dòng)劑)組,在gAD注射前30 min行側(cè)腦室注射TBCA;TBCA組,在MCAO前60 min行側(cè)腦室注射TBCA;Vehicle組,同前;DMSO組,T

7、BCA的溶劑,給藥時(shí)間及計(jì)量同TBCA組。于再灌注24 h后行行為學(xué)評(píng)分;梗死容積分析;抗氧化物酶SOD, catalase活性測(cè)定,MDA含量測(cè)定。
　　結(jié)果:
　　1、gAD可減少腦缺血-再灌注損傷
　　再灌注24 h后發(fā)現(xiàn),gAD組梗死容積顯著低于MCAO組(P<0.01,gAD vs.MCAO),同時(shí)神經(jīng)行為學(xué)也得到顯著的改善,與MCAO組相比(P=0.028,gAD vs.MCAO)。MCAO組Vehicle

8、組間無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、gAD可減少缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡
　　再灌注24 h,gAD可以減少缺血后腦組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05,gAD vs.MCAO),減少組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax/bcl2及cl-caspase3的表達(dá)(P<0.05,gAD vs. MCAO)。MCAO組Vehicle組間無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、gAD可增加MCAO機(jī)體抗氧化能力
　　再灌注24 h,gAD組血漿及

9、組織中抗氧化物酶SOD與catalase活性均增加(P<0.05,gAD vs.MCAO),MDA含量顯著減少(P<0.05,gAD vs.MCAO)。MCAO組Vehicle組間無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、gAD可抑制MCAO后NOX2表達(dá)
　　再灌注24 h,gAD可減少M(fèi)CAO后腦組織中NOX2的表達(dá)(P<0.05,gAD vs.MCAO)。MCAO組Vehicle組間無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5、TBCA組可

10、逆轉(zhuǎn)gAD的腦保護(hù)作用
　　給予NOX2激動(dòng)劑TBCA可逆轉(zhuǎn)gAD的腦保護(hù)及抗氧化能力作用。與gAD組相比,gAD+TBCA組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05,gAD vs.gAD+TBCA),腦梗死容積顯著增加(P<0.05,gAD vs.gAD+TBCA);與gAD組相比, gAD+TBCA組血漿中及組織中SOD與catalase活性均降低(P<0.05,gAD vs.gAD+TBCA), MDA含量明顯增加(P<0.01

11、,gAD vs.gAD+TBCA)。
　　結(jié)論:(1)gAD具有腦保護(hù)作用,且可減少缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡。
　　(2)gAD可通過(guò)增加機(jī)體抗氧化能力從而產(chǎn)生腦保護(hù)作用。
　　(3)gAD通過(guò)下調(diào)NOX2的表達(dá)從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,最終發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分:球狀脂聯(lián)素對(duì)Ⅰ型糖尿病小鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用及其抗凋亡機(jī)制研究
　　目的:
　　1、gAD對(duì)T1DM小鼠腦缺血是否有腦保護(hù)作用

12、
　　2、gAD抑制T1DM小鼠腦缺血損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)機(jī)制
　　方法:T1DM采用腹腔注射低劑量STZ(streptozotocin,STZ),連續(xù)注射5天的方法誘導(dǎo)造模。從第一天注射算起,1周后測(cè)血糖高于13.3mmol/L則為造模成功,納入實(shí)驗(yàn),并從該時(shí)間點(diǎn)作為T1DM的0天,每周規(guī)律測(cè)動(dòng)物血糖并稱體重。
　　1、I型糖尿病小鼠模型建立和血漿中APN的變化趨勢(shì)
　　T1DM采用腹腔注射低劑量STZ(st

13、reptozotocin,STZ),連續(xù)注射5天的方法誘導(dǎo)造模。從第一天注射算起,1周后測(cè)血糖高于13.3mmol/L則為造模成功,納入實(shí)驗(yàn),并從該時(shí)間點(diǎn)作為T1DM的0天,每周規(guī)律測(cè)動(dòng)物血糖并稱體重。同時(shí)通過(guò)ELASA方法測(cè)定不同病程小鼠腦組織中APN含量。
　　2、gAD對(duì)不同病程T1DM(2W和8W)小鼠腦缺血損傷的作用
　　觀察gAD(給藥方法及劑量同第一部分實(shí)驗(yàn))對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(T1DM-2W,8W)腦缺血/再灌注2

14、4 h后觀察神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死容積損傷的作用。
　　3、AdipoR1參與gAD對(duì) T1DM小鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用
　　采用免疫熒光雙標(biāo)及 western blot法測(cè)定 T1DM-2W,8W組小鼠腦組織中AdipoRs的表達(dá)。分別于 T1DM-2W組注射羅格列酮(RSG),T1DM-8W組轉(zhuǎn)染AdipoR1-siRNA,進(jìn)一步觀察干擾AdipoR1表達(dá)后對(duì)gAD在T1DM小鼠腦缺血損傷作用中的影響。
　　4、g

15、AD通過(guò)AdipoR1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕T1DM小鼠腦缺血損傷
　　通過(guò)western blot法測(cè)定給予AdipoR1-siRNA或AdipoR1-siRNA(n)對(duì)各組小鼠 MCAO后 ERS相關(guān)伴侶蛋白表達(dá)的影響;采用透射電鏡法觀察 ER顯微結(jié)構(gòu);TUNEL染色法觀察各組中細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　1、隨著T1DM病程組織APN呈規(guī)律變化
　　隨著T1DM病程進(jìn)展, APN呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì),早期即T1

16、DM-2W時(shí)血漿APN增加,后期T1DM-8W時(shí)APN下降;因此隨后的研究我們選取2W和8W兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
　　2、gAD對(duì)T1DM不同時(shí)期小鼠MCAO作用不同
　　再灌注24 h,gAD對(duì)T1DM-2W小鼠MCAO無(wú)保護(hù)作用,即與MCAO組相比, gAD組動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分無(wú)差別(P>0.05,gAD vs. MCAO),腦梗死容積無(wú)差異(P>0.05,gAD vs. MCAO);然而結(jié)果顯示,再灌注24 h,gAD對(duì)T1D

17、M-8小鼠MCAO具有神經(jīng)保護(hù)作用,即與 MCAO組相比,gAD組動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著改善(P<0.05,gAD vs. MCAO),腦梗死容積明顯減少(P<0.05,gAD vs. MCAO)。
　　3、T1DM早晚期小鼠腦組織中AdipoR1表達(dá)不同
　　免疫熒光染色和western blot結(jié)果均顯示,與Sham組相比,T1DM-2W小鼠腦組織中AdipoR1表達(dá)減少(P<0.05,Sham vs.T1DM-2W);

18、而AdipoR2表達(dá)幾乎無(wú)變化(P>0.05,Sham vs. T1DM-2W)。
　　隨著DM病程增加,與T2DM-2W小鼠相比,T1DM-8W動(dòng)物腦組織中AdipoR1表達(dá)增加(P<0.05,T1DM-2W vs.T1DM-8W);而AdipoR2表達(dá)兩組間幾乎無(wú)差異(P>0.05,T1DM-2W vs. T1DM-8W)。
　　4、調(diào)節(jié)AdipoR1表達(dá)可改變gAD在T1DM早晚期腦缺血中作用
　　結(jié)果顯示,T1

19、DM-2W小鼠腹腔注射RSG(rosiglitazone,腹腔注射,2mg/kg,4 h后行 MCAO)可改善 gAD對(duì) T1DM-2W小鼠腦保護(hù)作用,即與 gAD組相比,RSG+gAD組小鼠再灌注24 h后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分減少(P<0.05,gAD vs.RSG+gAD),腦梗死容積降低(P<0.05,gAD vs. RSG+gAD)。
　　T1DM-8W小鼠側(cè)腦室注射AdipoR1特異性siRNA(0.3nmol/μ L,1.2

20、nmol)可逆轉(zhuǎn)gAD對(duì)T1DM-8W小鼠腦保護(hù)作用,即與gAD組相比,siRNA+gAD組小鼠再灌注24 h后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增加(P<0.05,gAD vs. siRNA+gAD),腦梗死容積顯著增大(P<0.05,gAD vs.siRNA+gAD)。
　　5、gAD-AdipoR1通過(guò)抑制ERS-凋亡信號(hào)減少T1DM-8W腦缺血損傷
　　T1DM-8W小鼠行MCAO,再灌注24 h后,與缺血組相比,gAD組ERS伴侶

21、蛋白GRP78表達(dá)增加(P<0.05,gAD vs.MCAO),CHOP和caspase-12表達(dá)減少(P<0.05,gAD vs.MCAO),腦缺血半暗帶區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05,gAD vs.MCAO);而給予AdipoR1特異性siRNA可以逆轉(zhuǎn)gAD這一效應(yīng),即與gAD組相比,siRNA+gAD組GRP78表達(dá)明顯減少,CHOP和caspase-12表達(dá)增加,同時(shí)伴隨腦缺血半暗帶區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目大量