脂聯(lián)素對mTOR介導(dǎo)的早期糖尿病腎病的干預(yù)及保護(hù)作用研究.pdf

1、第一部分，脂聯(lián)素對PDGF-BB誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究
　　目的：探討重組人球形脂聯(lián)素蛋白對血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)增殖的影響及其內(nèi)在機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)，分別用不同濃度的PDGF-BB(0、1、5、10、20ng/ml)、不同濃度的重組人球形脂聯(lián)素蛋白(0、1、2.5、10μg/ml)、雷帕霉素(10nmol/l)和Co

2、mpoundC(AMPK抑制劑，10μmol/l)單獨或聯(lián)合干預(yù)HMCs于特定的時間，細(xì)胞計數(shù)及胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法檢測細(xì)胞增殖情況。將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對照組、PDGF-BB干預(yù)組、脂聯(lián)素干預(yù)組、PDGF-BB+脂聯(lián)素組、PDGF-BB+雷帕霉素組、PDGF-BB+脂聯(lián)素+Compound C組，Western blot檢測PI3K、AMPKα、TSC2、mTOR、S6K1蛋白磷酸化情況，免疫沉淀檢測脂聯(lián)素是否干擾PDG

3、F與其受體的結(jié)合。
　　結(jié)果：PDGF-BB能以劑量依賴性的方式促進(jìn)HMCs生長；脂聯(lián)素單獨對HMCs生長沒有影響；脂聯(lián)素抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HMCs生長；Compound C則能抑制脂聯(lián)素的效應(yīng)。PDGF-BB通過激活mTOR－S6K1信號通路誘導(dǎo)HMCs增殖；PDGF-BB誘導(dǎo)的mTOR-S6K1信號通路激活可以被脂聯(lián)素阻斷；脂聯(lián)素不干擾PDGF與其受體的結(jié)合。
　　結(jié)論：脂聯(lián)素通過激活A(yù)MPK信號通路抑制PDGF-

4、BB誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，可用于HMCs功能紊亂所致腎臟疾病的防治。
　　第二部分，人脂聯(lián)素基因重組慢病毒對PDGF－BB誘導(dǎo)的HMCs增殖及其細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的影響
　　目的：探討人脂聯(lián)素重組慢病毒(Lenti－apM1－EGFP)對PDGF－BB誘導(dǎo)的HMCs增殖及其細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的影響。
　　方法：將Lenti－apM1－EGFP感染HMCs，確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)，并觀察其細(xì)胞毒性。RT－PCR法檢測

5、慢病毒干預(yù)后HMCs內(nèi)脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。ELISA法檢測細(xì)胞上清液脂聯(lián)素蛋白水平。胸腺嘧啶核苷(3H－TdR)滲入法及流式細(xì)胞儀檢測PDGF－BB處理后HMCs及Lenti－apM1－EGFP感染后HMCs增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程改變。Western blotting檢測PDGF－BB處理后HMCs及Lenti-apM1-EGFP感染后HMCs內(nèi)Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Lenti－apM1－EGFP對

6、HMCs無明顯毒性；MOI為50的Lenti-apM1－EGFP能夠有效的感染HMCs，并使之穩(wěn)定表達(dá)脂聯(lián)素蛋白(149.6±12.8)μg/l。PDGF-BB能夠顯著促進(jìn)HMC增殖，加快細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白表達(dá)，對Lenti-apMl-EGFP感染后HMCs則沒有此效應(yīng)。
　　結(jié)論：Lenti-apM1-EGFP能夠安全有效的感染HMCs并使之穩(wěn)定表達(dá)脂聯(lián)素蛋白；脂聯(lián)素能夠抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的

7、HMCs增殖及ECM合成；為以脂聯(lián)素為靶基因的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分，脂聯(lián)素基因重組慢病毒對早期糖尿病腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　目的：探討靜脈應(yīng)用小鼠脂聯(lián)素基因重組慢病毒對早期糖尿病腎病模型小鼠的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　方法：40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC組)，糖尿病腎病組(DN組)，陰性對照病毒(Lenti-IRES-EGFP)治療組(DL組)，脂聯(lián)素基因重組慢病毒(Le

8、nti-Acdc-IRES-EGFP)治療組(DA組)，每組10只。采用腹腔小劑量多次注射鏈脲佐菌素(STZ)結(jié)合高脂高糖飲食的方法誘導(dǎo)小鼠糖尿病腎病模型。重組慢病毒注射8周后，觀測各組小鼠血漿脂聯(lián)素水平及腎組織形態(tài)學(xué)、腎功能、尿總蛋白、光鏡及電鏡下病理改變；應(yīng)用western blot方法檢測肝組織脂聯(lián)素蛋白表達(dá)。應(yīng)用ELISA法檢測小鼠血漿脂聯(lián)素蛋白表達(dá)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法原位檢測腎組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、p-AMPKα、p

9、-mTOR蛋白表達(dá)；
　　結(jié)果：成功構(gòu)建脂聯(lián)素超表達(dá)糖尿病腎病動物模型。與NC組比較，第12周末DA組小鼠腎臟肥大指數(shù)(KW/BW)、平均腎小球體積(MGV)、系膜面積比(FMA)、24h尿總蛋白(UTP)均明顯升高(P<0.05)，但低于DN組、DL組(P<0.05)。DA組腎組織PCNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于DN組、DL組(P<0.01)。與DN組、DL組相比，DA組小鼠腎組織p-AMPKα蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.01)，p-m