紅活麻總香豆素對糖尿病腎病保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定的糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）模型，研究比較1型和2型兩種糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的異同點，探討Toll樣受體4（TLR4）在兩種DN模型中的作用。
　　通過研究紅活麻總香豆素(Total coumarins)對高糖誘導(dǎo)下大鼠腎臟系膜細(xì)胞HBZY-1的保護(hù)作用，以及對STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病模型的作用，探討紅活麻總香豆素治療DN的效果以及其可能分子機(jī)制。
　　方法：（1）大鼠尾靜脈注

2、射大劑量鏈脲佐菌素（STZ,60mg/kg）建立1型糖尿病模型。高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量(30mg/kg)尾靜脈注射STZ2型糖尿病模型。每周測定大鼠體重、血糖、尿蛋白等糖尿病腎病相關(guān)指標(biāo)。第18周取大鼠血清測定肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）。取腎臟切片做HE和Masson染色，檢測大鼠腎臟結(jié)構(gòu)及纖維化程度。Western blot檢測大鼠腎臟轉(zhuǎn)

3、化生長因子（TGF-β1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、TLR4蛋白表達(dá)的變化。
　　（2）體外培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基(DMEM;NG,5.5mmol/L)饑餓培養(yǎng)24h后，更換高糖培養(yǎng)基（25mmol/L），同時用不同濃度紅活麻總香豆素干預(yù)，設(shè)高劑量（T1、100μg/ml）、中劑量（T2、50μg/ml）、低劑量（T3、10μg/ml）三個濃度梯度，分別培養(yǎng)24h、48h和96h；低糖培養(yǎng)基中加19.5mmol/

4、l甘露醇設(shè)為正常對照組。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況、體積大??；噻唑藍(lán)（MTT）法測定24h、48h和96h時各組細(xì)胞增殖情況。收集48h時細(xì)胞蛋白，Western blot測定TGF-β1、CTGF、TLR4蛋白表達(dá)水平。
　　（3）取60只雄性Wistar大鼠，10只空白對照，另外50只尾靜脈注射STZ60mg/kg建立大鼠糖尿病模型，注射當(dāng)天記為第0天。大鼠糖尿病造模成功后（空腹血糖平均值>16.65mmol/L），將50只模型

5、大鼠分組：模型對照組12只，紅活麻總香豆素高劑量組（100mg/kg）12只、紅活麻總香豆素中劑量組（50mg/kg）只、紅活麻總香豆素低劑量組（25mg/kg）12只。并開始給藥，紅活麻總香豆素組每日給予相應(yīng)劑量的紅活麻總香豆素，正常對照組和模型組分別給予等體積生理鹽水。給藥16周，測定大鼠血清測定肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。取腎臟切片分別做HE和Masson染色，檢測大鼠腎臟結(jié)構(gòu)及纖維化程度。Western blot法檢測大鼠

6、腎臟 TGF-β1、CTGF、TLR4蛋白表達(dá)水平。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測腎臟TGF-β1、CTGF、TLR4 mRNA的變化。
　　結(jié)果：（1）大劑量STZ和高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量注射STZ均可建立穩(wěn)定的DN大鼠模型，表現(xiàn)為大鼠煩渴、多尿、體重降低、血糖升高、尿蛋白升高、腎臟結(jié)構(gòu)和功能受到破壞。2型糖尿病模型出現(xiàn)高血脂癥狀，且在注射STZ3周即出現(xiàn)尿蛋白升高現(xiàn)象，1型糖尿病則在注射STZ8周時尿蛋白才開始升高。在腎臟結(jié)構(gòu)病理性改變上，

7、1型糖尿病腎病大鼠腎臟組織病理變化以糖原沉積為主要特征，而2型糖尿病腎病模型大鼠腎臟組織病變有糖原沉積未有1型模型顯著，但是其腎臟纖維化程度要高于1型。兩種DN大鼠模型腎臟TGF-β1、CTGF、TLR4表達(dá)均升高。
　?。?）高糖環(huán)境培養(yǎng)48h后，HBZY-1細(xì)胞體積顯著增大，紅活麻總香豆素組細(xì)胞體積小于高糖組；分別培養(yǎng)24h、48h、96h發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞增殖顯著大于正常對照組（P<0.01），紅活麻總香豆素高

8、、中、低劑量組細(xì)胞增殖速度小于高糖組（P<0.05），且中劑量（50μg/ml）組細(xì)胞數(shù)目最少。高糖環(huán)境下HBZY-1培養(yǎng)48h后，細(xì)胞TGF-β1、CTGF、TLR4蛋白水平顯著高于正常對照組（P<0.01），紅活麻總香豆素各組TGF-β1、CTGF、TLR4蛋白水平均下調(diào)，且中劑量組（50μg/ml）下降效果最為顯著（P<0.01）。
　?。?）紅活麻總香豆素可以緩解與糖尿病有關(guān)的代謝障礙。與模型組比較，給予紅活麻總香豆素后，

9、大鼠體重增長緩慢現(xiàn)象得到了改善（P<0.01）；血糖升高得到緩解，且中劑量組顯著低于模型組（P<0.01）。同時，紅活麻總香豆素可以提高DN大鼠腎臟功能，并且緩解腎小球的結(jié)構(gòu)破壞。實驗顯示，紅活麻總香豆素可以延緩STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病發(fā)病時間，降低24h尿蛋白量（P<0.01），中（50mg/kg）劑量組效果最好。血清肌酐和尿素氮檢測顯示，紅活麻總香豆素可以降低血清肌酐和尿素氮含量（與模型組比較，中低劑量組P<0.01）；病理檢測發(fā)現(xiàn)紅

10、活麻總香豆素可以緩解模型大鼠腎臟水腫、纖維化、糖原沉積等結(jié)構(gòu)破壞。此外，紅活麻給藥組腎臟組織中TGF-β1、CTGF、TLR4表達(dá)均顯著顯著下調(diào)，提示，紅活麻總香豆素對DN保護(hù)作用可能與降低TGF-β1、TLR4有關(guān)。
　　結(jié)論：（1）尾靜脈大劑量注射STZ和高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量注射STZ均可成功誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型。兩種DN模型在發(fā)病時間、脂代謝和腎臟病理改變方面存在差異。TGF-β1、TLR4均參與1型和2型糖尿病腎病的發(fā)