水產(chǎn)品中甲砜霉素殘留控制研究.pdf

1、甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)是一種廣譜抗菌素，其結(jié)構(gòu)類似于氯霉素，能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌和一些厭氧微生物，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖當(dāng)中并且會(huì)造成殘留。因此，研究和建立檢測方法成了當(dāng)務(wù)之急。本研究以多克隆抗體和免疫分析技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)酶聯(lián)免疫原理，建立了快速簡便的水產(chǎn)品中的酶聯(lián)免疫檢測方法。另外，還建立了相應(yīng)的儀器檢測方法。 首先通過混合酸酐法合成甲砜霉素與牛血清蛋白偶聯(lián)物，構(gòu)建甲砜霉素完全抗原。通過紫外掃描、

2、SDS-聚丙烯凝膠電泳和免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明了產(chǎn)物合成成功。 通過免疫新西蘭白兔，得到抗TAP的抗血清，抗血清效價(jià)高達(dá)1×106。此抗血清分別經(jīng)過飽和硫酸銨沉淀法、離子交換法和反向免疫親和層析法純化后，得到單一特異性的抗體，平均親和常數(shù)為7.8×10-9mol/L。以此抗體為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了間接競爭兩步酶聯(lián)免疫檢測方法，并優(yōu)化了緩沖液濃度、pH、吐溫20濃度等參數(shù)。此酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測限為0.06ng/mL，血液和組織回收率為80

3、～110％。通過重復(fù)性、檢測靈敏度、準(zhǔn)確性等指標(biāo)來評估此方法，并與氣相色譜法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，此間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法各項(xiàng)參數(shù)均能滿足實(shí)際檢測的需要。 建立和優(yōu)化了甲砜霉素殘留的高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)的檢測方法。方法的回收率分別為：HPLC為78.6～95.4％；HPLC/MS為72.6～99.8％；GC/MS為85.6～101.5％，相對偏差均小

4、于10％，檢出限分別為：HPLC為8.3μg/kg；HPLC/MS為0.1μg/kg；GC/MS為0.1μg/kg。結(jié)果表明，這些方法都能滿足實(shí)際檢測的需要。 以高效液相色譜法(HPLC)為檢測方法，研究了甲砜霉素在鱸魚血液和可食性組織里的消除規(guī)律。鱸魚單次口服5mg/kg(魚體)和30mg/kg(魚體)的甲砜霉素藥物后，藥物在血液中的達(dá)峰時(shí)間分別為6小時(shí)和8小時(shí)，藥物平均滯留時(shí)間的分別為11.1小時(shí)和11.9小時(shí)；甲砜霉素在鱸

5、魚血液中的經(jīng)時(shí)過程符合一級吸收二項(xiàng)指數(shù)方程：C=10.812(e-0.087te-0.274t)，藥物在鱸魚血液中的吸收半衰期為1.997h，消除半衰期為5.589h；連續(xù)5d口服15和30mg/kg(魚體)的甲砜霉素，藥物的吸收速率是一個(gè)常數(shù)，它在血液中的消除速率也是一個(gè)常數(shù)，這和單次口服結(jié)果一致，其消除速率方程分別為C血液=0.849e-0.494t；C肌肉=1.461e-0.682t，藥物在鱸魚血液和組織中的的消除半衰期分別為1.