糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的初步研究.pdf

1、目的：通過(guò)測(cè)定糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D(GPI-PLD)基因在冠心病病人與正常人之間表達(dá)的差異，并同時(shí)利用GPI-PLD基因轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，初步研究GPI-PLD基因過(guò)度表達(dá)對(duì)氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)HUVEC的影響，包括對(duì)其生長(zhǎng)及凋亡、細(xì)胞膜上糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞功能改變的影響，探討GPI-PLD基因在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，為該基因的抗動(dòng)脈粥樣硬化研究提供初步理論依據(jù)。

2、 方法： 1.分別取32名冠心病病人外周血和31名正常人外周血，測(cè)定其外周血GPI-PLD酶活性，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取RNA，測(cè)定GPI-PLD mRNA表達(dá)水平。 2.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將本室已經(jīng)構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/GPI-PLD轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染的HUVEC細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的細(xì)胞為對(duì)照，以G4.18篩選出陽(yáng)性細(xì)胞克隆。RT-PCR法鑒定GPI-PLD基因的m

3、RNA表達(dá)水平，利用自制具完整GPI結(jié)構(gòu)的胎盤(pán)型堿性磷酸酶(PLAP)做底物，通過(guò)曲拉通-114(TX-114)分相，定量檢測(cè)GPI-PLD活性；基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Ox-LDL誘導(dǎo)24小時(shí)，觀(guān)察細(xì)胞生物學(xué)特性的變化包括MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期凋亡變化，RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的T鈣粘連蛋白(T-CAD)以及內(nèi)皮素(ET)表達(dá)情況，硝酸還原法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的變化，另外用Caspase3活性檢測(cè)試劑盒

4、檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase3酶活性，丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、活性氧試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞MDA和活性氧的含量等，并設(shè)立空白組和空載對(duì)照組。 結(jié)果： 1.病人組和正常對(duì)照組外周血GPI-PLD酶活性分別為30.71±4.61％，44.14±4.43％，兩組差異有顯著性，外周單個(gè)核細(xì)胞GPI-PLD mRNA的相對(duì)表達(dá)量用積分分光密度比值(IA比值)表示分別為0.90±0.14，1.49±0.09，差異有顯著性意義。

5、 2.RT-PCR結(jié)果和GPI-PLD酶活性測(cè)定表明，穩(wěn)定高表達(dá)GPI-PLD的HUVEC細(xì)胞系已經(jīng)建立 ①G418篩選后，GPI-PLD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞的GPI-PLD mRNA相對(duì)表達(dá)量較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組明顯增高，差異有顯著性。 ②GPI-PLD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后，GPI-PLD活性較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組明顯增高，差異有顯著性意義，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的GPI-PLD活性(％)達(dá)到13.50±0.89，而其

6、它組細(xì)胞GPI-PLD活性極低，分別為0.40±0.07和0.35±0.09。 3.氧化型低密度脂蛋白Ox-LDL誘導(dǎo)各組細(xì)胞前后的細(xì)胞生物學(xué)特性的變化 ①M(fèi)TT和細(xì)胞周期測(cè)定表明Ox-LDL誘導(dǎo)24小時(shí)后，GPI-PLD轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組。 ②GPI-PLD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后，抗脂質(zhì)氧化能力增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)活性氧和丙二醛含量顯著低于誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，具有顯著性差異

7、。 ③誘導(dǎo)前各組細(xì)胞內(nèi)皮素ET-1、T-CAD和NO表達(dá)無(wú)顯著性差異，但誘導(dǎo)后GPI-PLD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞內(nèi)皮素ET-1表達(dá)顯著低于誘導(dǎo)后空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組內(nèi)皮細(xì)胞組，NO和T-CAD表達(dá)高于誘導(dǎo)后空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組內(nèi)皮細(xì)胞組，差異有顯著性。 ④各組內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)前，凋亡率無(wú)顯著性差異，誘導(dǎo)后GPI-PLD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞組較空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組凋亡下降，caspase3活性明顯低于其它兩組。 結(jié)論

8、： 1.分析冠心病病人和正常人外周血GPI-PLD酶活性及mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常人較患者的GPI-PLD酶活性和mRNA水平都要高，差異具有顯著性。 2.成功將GPI-PLD基因轉(zhuǎn)染入HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞，并在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 3.本試驗(yàn)證實(shí)GPI-PLD基因表達(dá)能夠拮抗Ox-LDL對(duì)細(xì)胞的損傷作用。即通過(guò)上調(diào)GPI-PLD活性，釋放GPI錨定蛋白如T-CAD等，降低內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)敏感性，防止內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，抑制