糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D抗動脈粥樣硬化作用的初步研究.pdf

1、目的：通過測定糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D(GPI-PLD)基因在冠心病病人與正常人之間表達的差異，并同時利用GPI-PLD基因轉染臍靜脈內皮細胞HUVEC，初步研究GPI-PLD基因過度表達對氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導HUVEC的影響，包括對其生長及凋亡、細胞膜上糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白質、內皮細胞功能改變的影響，探討GPI-PLD基因在動脈粥樣硬化中的作用，為該基因的抗動脈粥樣硬化研究提供初步理論依據。

2、 方法： 1.分別取32名冠心病病人外周血和31名正常人外周血，測定其外周血GPI-PLD酶活性，分離外周血單個核細胞，提取RNA，測定GPI-PLD mRNA表達水平。 2.用脂質體轉染法將本室已經構建的真核表達載體pcDNA3.1(+)/GPI-PLD轉入HUVEC細胞，以未轉染的HUVEC細胞及轉染空載體pcDNA3.1(+)的細胞為對照，以G4.18篩選出陽性細胞克隆。RT-PCR法鑒定GPI-PLD基因的m

3、RNA表達水平，利用自制具完整GPI結構的胎盤型堿性磷酸酶(PLAP)做底物，通過曲拉通-114(TX-114)分相，定量檢測GPI-PLD活性；基因穩(wěn)定轉染后Ox-LDL誘導24小時，觀察細胞生物學特性的變化包括MTT法檢測各組細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞周期凋亡變化，RT-PCR檢測內皮細胞HUVEC的T鈣粘連蛋白(T-CAD)以及內皮素(ET)表達情況，硝酸還原法檢測內皮細胞NO產生的變化，另外用Caspase3活性檢測試劑盒

4、檢測各組細胞Caspase3酶活性，丙二醛(MDA)測定試劑盒、活性氧試劑盒檢測各組細胞MDA和活性氧的含量等，并設立空白組和空載對照組。 結果： 1.病人組和正常對照組外周血GPI-PLD酶活性分別為30.71±4.61％，44.14±4.43％，兩組差異有顯著性，外周單個核細胞GPI-PLD mRNA的相對表達量用積分分光密度比值(IA比值)表示分別為0.90±0.14，1.49±0.09，差異有顯著性意義。

5、 2.RT-PCR結果和GPI-PLD酶活性測定表明，穩(wěn)定高表達GPI-PLD的HUVEC細胞系已經建立 ①G418篩選后，GPI-PLD穩(wěn)定轉染HUVEC細胞的GPI-PLD mRNA相對表達量較轉染空質粒組和未轉染組明顯增高，差異有顯著性。 ②GPI-PLD穩(wěn)定轉染HUVEC細胞后，GPI-PLD活性較轉染空質粒組和未轉染組明顯增高，差異有顯著性意義，轉染組細胞的GPI-PLD活性(％)達到13.50±0.89，而其

6、它組細胞GPI-PLD活性極低，分別為0.40±0.07和0.35±0.09。 3.氧化型低密度脂蛋白Ox-LDL誘導各組細胞前后的細胞生物學特性的變化 ①MTT和細胞周期測定表明Ox-LDL誘導24小時后，GPI-PLD轉染組細胞增殖能力明顯強于轉染空質粒組和未轉染組。 ②GPI-PLD穩(wěn)定轉染HUVEC細胞后，抗脂質氧化能力增強，細胞內活性氧和丙二醛含量顯著低于誘導后轉染空質粒組和未轉染組細胞，具有顯著性差異

7、。 ③誘導前各組細胞內皮素ET-1、T-CAD和NO表達無顯著性差異，但誘導后GPI-PLD穩(wěn)定轉染HUVEC細胞內皮素ET-1表達顯著低于誘導后空質粒組和未轉染組內皮細胞組，NO和T-CAD表達高于誘導后空質粒組和未轉染組內皮細胞組，差異有顯著性。 ④各組內皮細胞誘導前，凋亡率無顯著性差異，誘導后GPI-PLD穩(wěn)定轉染HUVEC內皮細胞組較空質粒組和未轉染組凋亡下降，caspase3活性明顯低于其它兩組。 結論

8、： 1.分析冠心病病人和正常人外周血GPI-PLD酶活性及mRNA表達，發(fā)現(xiàn)正常人較患者的GPI-PLD酶活性和mRNA水平都要高，差異具有顯著性。 2.成功將GPI-PLD基因轉染入HUVEC內皮細胞，并在細胞中穩(wěn)定表達。 3.本試驗證實GPI-PLD基因表達能夠拮抗Ox-LDL對細胞的損傷作用。即通過上調GPI-PLD活性，釋放GPI錨定蛋白如T-CAD等，降低內皮細胞對脂質敏感性，防止內皮細胞功能紊亂，抑制