利用原生質(zhì)體融合及基因工程的方法對柑橘采后生防菌34-9遺傳改良的初步研究.pdf

1、生防酵母菌34-9(Kloeckeraapiculata)是本實驗室從自然界中自主分離得到的,對柑橘青、綠霉病具有很強(qiáng)的拮抗作用,但因絮凝性差、生物量低、抗菌譜窄和抑菌活性有待提高等問題,限制了其商業(yè)化應(yīng)用。為了提高現(xiàn)有生防酵母的綜合性狀,迫切需要對其在基因水平上進(jìn)行遺傳改良,同時為進(jìn)一步開發(fā)出新型、安全無毒、多功能的生物保鮮劑提供理論依據(jù)。
　　 本研究對菌株34-9的遺傳改良進(jìn)行了初步探索。采用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù),分析

2、了影響親本菌株34-9和釀酒酵母原生質(zhì)體制備與再生的主要因素,明確了原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件,確立了原生質(zhì)體滅活條件,對融合子進(jìn)行了初步篩選和鑒定。同時利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、醋酸鋰法和電轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化方法,對菌株34-9轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了摸索,并對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了初步鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用rDNA-ITS分子鑒定,進(jìn)一步證實了菌株34-9的屬、種名。確定該菌株為檸檬形克勒克氏酵母(K.apiculata),是有孢漢

3、遜酵母屬(Hanseniasporauvarum)的無性世代。
　　 2.分別確定了菌株34-9和釀酒酵母原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件。菌株34-9原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件:采用0.05mol/LEDTA-Na2和0.5％β-巰基乙醇混合液,28℃預(yù)處理10min；培養(yǎng)時間為16h；酶解液濃為1.5％的蝸牛酶,酶解時間為3h；滲透壓穩(wěn)定劑為0.8mol/L的KCl溶液。釀酒酵母原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件:最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基為K

4、leyn；培養(yǎng)時間為26h:酶解液濃度為1.5％的蝸牛酶,酶解時間為2h:滲透壓穩(wěn)定劑為0.8mol/L的蔗糖溶液。
　　 3.確立了菌株34-9和釀酒酵母原生質(zhì)體滅活的適宜條件。菌株34-9化學(xué)滅活的參數(shù):0.9％的碘乙酸作用10min；釀酒酵母熱滅活參數(shù):55℃作用15min。在28℃條件下,利用35％PEG-4000作為促融劑進(jìn)行融合。
　　 4.以菌株34-9和釀酒酵母為親本,進(jìn)行原生質(zhì)體雙親滅活和融合,經(jīng)過菌落