柑橘采后生防菌檸檬形克勒克酵母(34-9)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、檸檬形克勒克酵母(Kloechera apiculata)菌株34-9是一株對柑橘采后真菌病害具有良好防治效果的生防酵母菌株。為了提高其生防效力，進一步改良酵母以利于商業(yè)化運用，本實驗主要對檸檬形克勒克酵母的遺傳轉(zhuǎn)化方法進行了探索，包括醋酸鋰法、電轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體法及其他轉(zhuǎn)化方法。在確立合適轉(zhuǎn)化方法的基礎(chǔ)上，我們將克隆抗病相關(guān)基因并使之在檸檬形克勒克酵母中高水平表達。實驗室已經(jīng)研究得出檸檬形克勒克酵母分泌產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)是苯乙醇，能顯著

2、抑制青、綠霉病的發(fā)生。本實驗克隆了苯乙醇合成的關(guān)鍵酶丙酮酸脫羧酶基因PDC并在畢赤酵母中表達驗證其活性，為下一步試驗PDC在菌株34-9中大量表達作準備，以最終提高其拮抗效力。主要實驗結(jié)果如下：
　　 1.對潮霉素B敏感性檢測確定使用100μg/mL潮霉素B作為菌株34-9抗性篩選濃度。將構(gòu)建了同源臂的重組載體轉(zhuǎn)化到野生畢赤酵母菌X-33得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，驗證重組載體可以用于轉(zhuǎn)化。
　　 2.采用醋酸鋰法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方

3、法進行了轉(zhuǎn)化實驗，對細胞濃度、質(zhì)粒線性化和非線性化濃度、轉(zhuǎn)化試劑濃度、轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)時間等條件進行篩選，多次試驗并未得到轉(zhuǎn)化子。原生質(zhì)體細胞膜外DNase酶活性高，但是限制DNase活性后轉(zhuǎn)化也未得到轉(zhuǎn)化子，表明DNase活性并不是限制轉(zhuǎn)化的主要因素。
　　 3.進行了電轉(zhuǎn)化方法試驗，計算酵母在不同電壓下的存活率，本實驗選取1.5 kV電壓進行電擊，并設(shè)置其他轉(zhuǎn)化條件。采用電轉(zhuǎn)化方法獲得了少量轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率低，初步確定轉(zhuǎn)化條件為酵