堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和纖維粘連蛋白對(duì)成骨細(xì)胞在生物衍生骨支架上黏附的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、探討了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和纖維粘連蛋白對(duì)成骨細(xì)胞在生物衍生骨支架上黏附的影響及其機(jī)制，研究堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和纖維粘連蛋白(FN)在單一和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞在生物衍生骨支架上黏附的影響，分析了骨組織工程中能夠有效促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附的兩種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白濃度的最佳組合方式，以及產(chǎn)生此種影響的潛在機(jī)制。 本文采用體外培養(yǎng)乳大鼠顱骨成骨細(xì)胞，并對(duì)其成骨表型進(jìn)行堿性磷酸酶染色和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色鑒定，并制備

2、生物衍生骨對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。第三代成骨細(xì)胞分別用不同濃度的bFGF(0.1，1，10和100ng/ml)刺激；制備的生物衍生骨分別用不同濃度的FN(0.1，1，10和100μg/ml)和多聚賴(lài)氨酸(PLL)修飾。隨后不同刺激的成骨細(xì)胞依次接種于不同修飾的生物衍生骨支架上，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測(cè)各種組合間細(xì)胞在支架上的黏附差異，掃描電鏡觀(guān)察上架細(xì)胞的密度與形態(tài)。根據(jù)MTT法檢測(cè)結(jié)果，選擇最佳濃度組合，設(shè)置對(duì)照組

3、，以1mmol/L GRGDS肽溶液封閉RGD-整合素α5β1黏附途徑，再次重復(fù)上述MTT測(cè)定；Western-Blot檢測(cè)bFGF是否對(duì)成骨細(xì)胞上的FN受體-整合素β1亞單位的表達(dá)產(chǎn)生影響。 研究結(jié)果表明：所培養(yǎng)細(xì)胞成骨表型鑒定顯示堿性磷酸酶染色及鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色陽(yáng)性；制備的生物衍生骨材料，掃描電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)其保留了原骨組織的天然三維網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)和骨鹽結(jié)構(gòu)，蛋白含量測(cè)定為0.01±0.007％，示蛋白含量極微。MTT法測(cè)定結(jié)果顯

4、示單獨(dú)應(yīng)用bFGF刺激細(xì)胞或FN修飾支架均可增強(qiáng)成骨細(xì)胞在生物衍生骨支架上的黏附效應(yīng)(P<0.05)，二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)生的細(xì)胞黏附促進(jìn)效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，二者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的交互作用(P<0.01)，其中以100ng/ml bFGF刺激細(xì)胞接種于10μg/ml FN修飾的生物衍生骨支架上產(chǎn)生的黏附促進(jìn)作用最強(qiáng)。單獨(dú)應(yīng)用PLL修飾支架未能促進(jìn)成骨細(xì)胞在生物衍生骨上的黏附(P>0.05)，PLL與bFGF亦不存在成骨細(xì)胞黏附促進(jìn)的交互作用(P>

5、0.05)電鏡觀(guān)察也證明， bFGF與FN聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的細(xì)胞密度、鋪展效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。以GRGDS肽封閉后，bFGF聯(lián)合FN產(chǎn)生的黏附促進(jìn)作用被顯著阻斷。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用bFGF刺激后，成骨細(xì)胞整合素β1亞單位表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論：bFGF與FN對(duì)成骨細(xì)胞在生物衍生骨三維支架上的黏附存在協(xié)同促進(jìn)作用，當(dāng)100ng/ml bFGF刺激的細(xì)胞接種于10μ/ml FN修飾的生物衍生骨支架時(shí)可產(chǎn)生最大的黏附促進(jìn)效應(yīng)，而產(chǎn)