多孔組織工程材料捕獲細胞的應用基礎研究.pdf

1、干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞群體,已廣泛應用于各種疾病的治療。干細胞可分為胚胎干細胞,成體干細胞和誘導性多潛能干細胞。成體干細胞由于取材方便,沒有倫理學限制和安全性等問題,成為目前臨床應用中最主要的干細胞,如：間充質干細胞,造血干細胞等。研究證實成體骨髓、肌肉、脂肪等組織都存在間充質干細胞和造血干細胞,但體內各組織中干細胞比例極低,直接從機體獲取干細胞數(shù)量非常有限。因此尋找新的干細胞來源或者新的干細胞獲取方法是目前國內外

2、干細胞研究的熱點,也是臨床需要解決的一個難題。本文利用多孔組織工程材料植入動物體內,探索一種新的、高效的造血干細胞和間充質干細胞獲取方法。在前期研究中發(fā)現(xiàn)體內埋植多孔組織工程材料方法所捕獲細胞中存在造血干細胞,且捕獲細胞中貼壁細胞表達間充質干細胞表面標志物,但捕獲細胞中是否存在間充質干細胞需要進一步證實,且捕獲細胞中造血干細胞和間充質干細胞的比例和應用價值也需要進一步探索。
　　 目的：①通過對多孔組織工程材料捕獲造血干細胞進行

3、定量分析,并與骨髓中造血干細胞比例進行比較,探索多孔組織工程材料捕獲造血干細胞的應用價值。②證實捕獲細胞中間充質干細胞的存在,比較捕獲間充質干細胞與骨髓、肌肉間充質干細胞的生物學特性,探索多孔組織工程材料捕獲間充質干細胞的應用價值。③探討捕獲間充質干細胞移植對假肥大型肌營養(yǎng)不良癥模型鼠(mdx鼠)的治療作用。
　　 方法：⑴移植多孔明膠海綿到小鼠后肢大腿內側肌間隙,分別在3d、6d、9d、12d、15d、18d取出材料,稱取海綿

4、重量,計數(shù)捕獲細胞數(shù)。用胎盤藍拒染法、集落形成細胞檢測法等方法檢測捕獲細胞和骨髓細胞中細胞活力和造血干細胞頻率。⑵差速貼壁法分離捕獲細胞,骨髓和肌肉中的間充質干細胞,用倒置顯微鏡、成纖維細胞集落形成單位(CFU-F)檢測法、細胞計數(shù)、體外誘導分化及細胞染色等方法比較三者的細胞形態(tài)、細胞頻率、增殖能力和多向誘導分化能力等生物學特性。此外,應用RT-PCR檢測捕獲間充質干細胞“多能”表面標志物的表達,性染色體標記法初步探索捕獲細胞中干細胞的

5、來源。⑶將正常雄性C57BL/6小鼠的捕獲間充質干細胞和骨髓間充質干細胞肌肉多點注射移植入雌性mdx鼠體內,以未治療mdx鼠和健康C57BL/6小鼠為對照組。12周后通過強迫游泳實驗觀察小鼠的運動能力變化,肌肉組織HE染色檢測肌肉病理的改變,應用免疫熒光、RT-PCR、Western-blot檢測腓腸肌dystrophin蛋白的表達,另進行PCR反應檢測移植治療mdx鼠腓腸肌內sry基因。
　　 結果：①第12天時捕獲細胞數(shù)量達

6、到最大值;捕獲細胞的活力明顯弱于骨髓細胞(P＜0.05);誘導14天后,捕獲細胞的造血集落相似于骨髓細胞;但頻率和各種克隆的頻率均高于骨髓(p＜0.05),但兩者來源各種造血克隆比比較接近。②捕獲細胞貼壁細胞與骨髓間充質干細胞、肌肉間充質干細胞有相似的細胞形態(tài),增殖能力,骨、軟骨和脂肪誘導分化能力,但捕獲細胞中CFU-F的比例高于骨髓細胞和肌肉細胞中比例(P＜0.05)。此外,捕獲間充質干細胞表達“多能”表面標志物rex-1和nanog

7、,而不表達oct-4。捕獲細胞中的干細胞可來源于外周循環(huán)血。③捕獲間充質干細胞治療組mdx鼠較未治療組mdx鼠運動功能似乎有所改善,但沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05);肌肉病理明顯改善,肌纖維核內移明顯減少(P＜0.05);dystrophin蛋白陽性表達。但與骨髓間充質干細胞治療效果相比沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。另外,移植治療的雌性mdx鼠腓腸肌sry-基因均為陽性。
　　 結論：⑴最佳的埋植時間是12天,捕獲細胞中的造血