組織工程周圍神經(jīng)的構(gòu)建及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、本課題旨在研制組織工程周圍神經(jīng)，以解決長(zhǎng)段神經(jīng)損傷修復(fù)中供體神經(jīng)來(lái)源缺乏問(wèn)題。包括導(dǎo)管材料制備與表征、導(dǎo)管制作、神經(jīng)生長(zhǎng)因子的固定化、種子細(xì)胞的分離培養(yǎng)，并對(duì)所構(gòu)建的組織工程周圍神經(jīng)進(jìn)行了系統(tǒng)的功能評(píng)價(jià)，以明確各影響因素在坐骨神經(jīng)損傷后修復(fù)過(guò)程中的作用。
　　 殼聚糖(chitosan，CS)是一種天然的聚陽(yáng)離子多糖，具有無(wú)毒、生物可降解、不會(huì)引起排異反應(yīng)等特點(diǎn)。但由于其脆性較高，不易加工，因而應(yīng)用受到一些限制。聚乳酸(poly

2、lactide，PLA)具有優(yōu)良的機(jī)械力學(xué)性能，對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)刺激、可以被人體吸收，因而已被美國(guó)食品和藥品管理局(FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用作藥物控釋載體及修復(fù)材料。但PLA存在親水性及組織相容性差，降解產(chǎn)物會(huì)引起局部酸性炎癥等不足。本課題采用接枝共聚法制備殼聚糖/聚乳酸的復(fù)合材料，以達(dá)到整合兩者優(yōu)點(diǎn)，克服兩者不足的目的。
　　 靜電自組裝（electrostaticself-assemb

3、ly，ESA）技術(shù)已成為一種日益引起廣大生物材料工作者興趣的新型制備方法，它是基于相反電荷電解質(zhì)相互吸附的超薄膜形成技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成膜穩(wěn)定性好、不受基材形狀和大小的限制。現(xiàn)已在生物材料改性、藥物緩釋、生物傳感器制備等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本課題采用靜電自組裝技術(shù)，將殼聚糖及肝素固定在5/0手術(shù)縫合線表面，制備神經(jīng)引導(dǎo)絲。并通過(guò)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-eth

4、ylcarbodiimidehydrochloride，EDC）交聯(lián)將神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nervegrowthfactor,NGF）固定于神經(jīng)引導(dǎo)絲及導(dǎo)管支架材料表面，以達(dá)到緩釋NGF的作用。
　　 組織工程神經(jīng)導(dǎo)管的種子細(xì)胞中雪旺細(xì)胞是最理想的，其作用包括分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)，表達(dá)粘附分子，引導(dǎo)軸突再生等。但雪旺細(xì)胞本身是一種終末期細(xì)胞，體外培養(yǎng)的增殖能力差，很難達(dá)到移植所需的理想數(shù)量，且自體取材易造成新的損傷，故使其

5、在臨床使用中受到一定的限制。骨髓來(lái)源的干細(xì)胞是較為理想的雪旺細(xì)胞替代細(xì)胞。本課題采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)作為種子細(xì)胞。
　　 隨著交通方式的改變及機(jī)械化大生產(chǎn)的發(fā)展，當(dāng)前每年都有大量人員遭受周圍神經(jīng)損傷。顯微外科手術(shù)仍是現(xiàn)階段臨床上廣泛采用的治療手段，對(duì)于5mm以上的神經(jīng)損傷只能采用自體移植方法，但神經(jīng)來(lái)源有限，且會(huì)造成新的損傷。因此研究者開(kāi)始將著眼于采用組

6、織工程技術(shù)修復(fù)長(zhǎng)距離的神經(jīng)損傷。該領(lǐng)域重點(diǎn)問(wèn)題包括:①神經(jīng)導(dǎo)管材料選擇和表面形態(tài)修飾。②神經(jīng)導(dǎo)管與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的聯(lián)合應(yīng)用。③選擇并添加合適的種子細(xì)胞。本課題的工作即在此領(lǐng)域展開(kāi)，主要包括:
　　 1.殼聚糖/聚乳酸復(fù)合材料的構(gòu)建及性能研究
　　 采用接枝共聚法制備殼聚糖/聚乳酸復(fù)合材料，并利用固態(tài)核磁、單反射紅外光譜、X射線衍射及掃描電子顯微鏡對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征。測(cè)定殼聚糖氨基取代度、乳酸聚合度、孔隙率、溶脹性能、體內(nèi)

7、外降解速率、體外降解pH變化及細(xì)胞親和性、組織相容性。結(jié)果表明，隨乳酸與殼聚糖質(zhì)量比的增大，復(fù)合材料孔隙率和溶脹性能逐漸減小，體外降解pH呈波動(dòng)性變化，且隨乳酸量的增大波動(dòng)性逐漸增大，體內(nèi)外降解質(zhì)量減少隨乳酸量的增大逐漸增大，在所設(shè)的三種比例下，復(fù)合材料的細(xì)胞親和性和組織相容性都較好。
　　 2.組織工程神經(jīng)的構(gòu)建
　　 2.1殼聚糖/聚乳酸復(fù)合材料神經(jīng)導(dǎo)管的制備
　　 采用自制模具，利用冷凍干燥及高溫真空干燥方

8、法制備復(fù)合材料導(dǎo)管支架。并對(duì)其力學(xué)性能及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，復(fù)合材料導(dǎo)管與殼聚糖導(dǎo)管相比可有效提高力學(xué)性能，且導(dǎo)管支架呈瓦片狀，能夠有效防止周圍組織的長(zhǎng)入，同時(shí)有利于損傷神經(jīng)進(jìn)行物質(zhì)交換，能夠?yàn)樯窠?jīng)的再生提供良好的微環(huán)境。
　　 2.2神經(jīng)引導(dǎo)絲的靜電自組裝修飾
　　 采用可降解的聚乙醇酸5/0手術(shù)縫合線為載體，在其表面制備聚乳酸涂層，利用靜電自組裝技術(shù)在其表面制備殼聚糖/肝素多層膜結(jié)構(gòu)，并通過(guò)紅外光譜、X射線光

9、電子能譜及掃描電子顯微鏡進(jìn)行表征。結(jié)果表明，神經(jīng)引導(dǎo)絲表面已形成殼聚糖/肝素多層膜。并且在復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管后，可有效地增大導(dǎo)管的內(nèi)表面積。
　　 2.3NGF的交聯(lián)固定
　　 采用EDC交聯(lián)方式在神經(jīng)引導(dǎo)絲及導(dǎo)管支架上固定NGF，以達(dá)到在神經(jīng)修復(fù)期間緩釋NGF的作用。結(jié)果表明，經(jīng)釋放前期其呈現(xiàn)突釋，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)其逐漸呈平穩(wěn)釋放;且由于表面積大的原因，神經(jīng)導(dǎo)管固定NGF的量明顯多于神經(jīng)引導(dǎo)絲。
　　 2.4BMSCs

10、作為種子細(xì)胞的分離及熒光標(biāo)記
　　 采用市售試劑盒，按照密度梯度離心法分離大鼠BMSCs與并與神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合構(gòu)建組織工程神經(jīng)，應(yīng)用于大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)，采用Hoechst33258對(duì)BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合免疫組化方法檢測(cè)其分化狀態(tài)。結(jié)果表明在手術(shù)6w后BMSCs依然存活，并且有nestin的表達(dá)，表明其已經(jīng)分化為類神經(jīng)元細(xì)胞。
　　 3.組織工程神經(jīng)對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的效果觀察及初步機(jī)制研究
　　 采用大鼠

11、坐骨神經(jīng)損傷模型，以神經(jīng)電生理指數(shù)，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)，神經(jīng)的纖維密度、直徑及nestin免疫組化為考察指標(biāo)，對(duì)比研究了空白組、造模組、自體移植組、組織工程神經(jīng)組、導(dǎo)管復(fù)合NGF組、導(dǎo)管復(fù)合干細(xì)胞組、固定有NGF的引導(dǎo)絲組、靜電自組裝修飾后的引導(dǎo)絲組、吡咯喹啉醌組、復(fù)合材料各組、殼聚糖組、聚乳酸組修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷的效果，按效果從優(yōu)到劣的排序是:自體移植組、組織工程神經(jīng)組、NGF組、干細(xì)胞組、生長(zhǎng)因子引導(dǎo)絲組、自組裝引導(dǎo)絲組、吡咯

12、喹啉醌組、復(fù)合材料-Ⅱ組、復(fù)合材料-Ⅰ組、復(fù)合材料-Ⅲ組、殼聚糖組、聚乳酸組、造模組。熒光標(biāo)記和免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明，nestin在組織工程神經(jīng)組及干細(xì)胞組均有表達(dá)，表明BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞的方向進(jìn)行了分化，推測(cè)這是所構(gòu)建的組織工程神經(jīng)具有良好修復(fù)作用的機(jī)制。
　　 本研究取得的主要研究成果有:
　　 1.制備了殼聚糖/聚乳酸復(fù)合材料并對(duì)其理化性能，體內(nèi)外降解性能，細(xì)胞親和性及組織相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為制備適宜的組織工程材

13、料提供依據(jù)。
　　 2.利用靜電自組裝技術(shù)修飾神經(jīng)引導(dǎo)絲，在其表面制備肝素/殼聚糖膜，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征;利用EDC交聯(lián)固定NGF，體外檢測(cè)顯示其可緩釋NGF;利用模具制作殼聚糖/聚乳酸復(fù)合材料支架。研究表明，復(fù)合材料-Ⅱ組的力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)更有利于損傷神經(jīng)的修復(fù)。
　　 3.評(píng)價(jià)了各影響因素在大鼠周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)中的效果。結(jié)果顯示各組修復(fù)情況排序?yàn)?自體移植組、組織工程神經(jīng)組、NGF組、干細(xì)胞組、生長(zhǎng)因子引導(dǎo)絲