海水淹溺兔肺泡巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)及地塞米松干預(yù)作用.pdf

1、海水淹溺（Sea water drowning）不僅常發(fā)生于航海事故、海上作業(yè)、海上旅行等，而且是軍隊(duì)海上訓(xùn)練和作戰(zhàn)減員的重要原因[1]。海水淹溺可導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴(yán)重者可發(fā)展為海水型呼吸窘迫綜合征（sea water respiratory distress syndrome，SW-RDS），病情嚴(yán)重，救治極為困難[2]。因此，研究海水型ALI的早期救治，并防止其向SW-RDS轉(zhuǎn)化，具有重

2、要的意義。有學(xué)者報(bào)道地塞米松可以減輕海水淹溺后急性肺損傷，但具體機(jī)制尚不明確[3-4]。普遍認(rèn)為TNF-α是導(dǎo)致ALI/ARDS的啟動(dòng)因子[5-7]，而海水淹溺后TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)及地塞米松對(duì)海水淹溺后巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α分子表達(dá)的影響尚未報(bào)道。本研究試圖闡明TNF-α在SW-RDS發(fā)病機(jī)制中的作用，探索地塞米松對(duì)海水型ALI的治療機(jī)制。
　　目的：通過向兔氣管內(nèi)灌注海水，模擬海水淹溺后導(dǎo)致ALI生理過程，在灌注后不同時(shí)

3、點(diǎn)觀察AM內(nèi)TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并應(yīng)用地塞米松（Dexamethasone，Dex）進(jìn)行干預(yù)，探討地塞米松對(duì)海水淹溺急性肺損傷的治療作用及相應(yīng)的機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：
　　健康新西蘭大耳兔40只(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重（2.50±0.36）kg。為觀察海水淹溺后肺泡巨噬細(xì)胞（AM）內(nèi)TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)，25只兔隨機(jī)分成5組：海水淹溺后0min（正常對(duì)照組）、30、60、

4、90、120min時(shí)點(diǎn)組；為了解地塞米松對(duì)海水淹溺后AM內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá)的影響，15只兔隨機(jī)分為3組（每組5只）：①對(duì)照組（Control group，C組）：僅作氣管插管，不作其他處理；②海水淹溺組（Model group，M組）：制備動(dòng)物模型，以等量生理鹽水代替地塞米松靜脈注射。③地塞米松治療組（Treatment group，T組）：模型建立后立即靜脈注射地塞米松2mg/kg，隨即以（1mg·kg-1·h-1）靜脈維持。<

5、br>　　2.建立海水淹溺家兔急性肺損傷模型
　　3．動(dòng)脈血?dú)夥治龈鹘M均于手術(shù)或模型建立后0min、30min、60min、90min、120min經(jīng)左側(cè)股內(nèi)動(dòng)脈采集0.5ml動(dòng)脈血注入抗凝試管用于動(dòng)脈血?dú)夥治?，采?.6ml，血?dú)夥治鲇傻谒能娽t(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院血?dú)?肺功能室測(cè)定。
　　4．支氣管肺泡灌洗液（BALF）的采集：25只時(shí)點(diǎn)組兔于上述各時(shí)點(diǎn)放血處死，C組、M組、T組于100分鐘放血處死，隨后開胸、夾閉氣管取全肺。左側(cè)

6、肺葉作肺泡灌洗:生理鹽水以5ml/次，共10ml，回收率70％左右。
　　5．肺組織的離體觀察
　　分別于致傷后0min、30min、60min、90min、120min分批處死家兔，取肺組織，觀察肺臟的肉眼變化，并使用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。肺組織含水量測(cè)定:采用干濕重稱重法測(cè)定:：取得右肺上、中葉，稱取肺濕重(W)，而后置于100℃恒溫烤箱內(nèi)48h至重量恒定后稱肺干重(D)，肺含水量=(肺濕重－肺干重)／肺干重。取左肺下葉組織

7、稱重標(biāo)記，冷凍保存于-70℃環(huán)境。測(cè)量腫瘤壞死因子a（TNF-a）、IL-10的含量。各組于右下葉同等部位取0.5g肺組織置于10％福爾馬林溶液中，固定組織塊，經(jīng)石蠟包埋切片，HE染色后，觀察組織病理學(xué)改變。
　　6．肺泡巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　將支氣管肺泡灌洗液1000r／min離心10min，沉淀用D-Hank液洗滌，以RPMI-1640懸浮后，置25mL玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％二氧化碳、PH7.2條件下培養(yǎng)4

8、小時(shí)，等AM黏附于玻璃表面，再用培養(yǎng)液沖洗掉未黏附的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，分離純化的AM以瑞氏染色證實(shí)為巨噬細(xì)胞，純度>95％，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力>90％。
　　7．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)兔肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-amRNA表達(dá)
　　結(jié)果：
　　（1）血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，PE-SWD模型建立后，60min時(shí)，PaO2降低到到最低點(diǎn)(31.6±4.98mmHg，1mmHg=0.133kPa)后逐漸升高，

9、到120分鐘再次降低；PCO2在30min升至最高點(diǎn)，后逐漸回復(fù)，可能與家兔代償性過度通氣有關(guān)；PH值和D/W在模型建立后進(jìn)行性下降。
　　(2)病理學(xué)檢查結(jié)果顯示：大體標(biāo)本可見海水淹溺后雙肺表面散在暗紅色片狀區(qū)及點(diǎn)狀出血區(qū)，以雙下肺背側(cè)為主，呈“紅色肝樣變”，肺組織切面及氣管腔內(nèi)有中量血性粉紅色泡沫樣液體滲出。以地塞米松治療后的T組亦可見基本相同的肺損傷區(qū)域，但總體顏色較淡。HE染色（×100倍）下，M組可見肺泡及肺間質(zhì)水腫明顯

10、，肺出血、肺泡隔斷裂，肺泡腔及微血管中大量炎癥細(xì)胞（主要為中性粒細(xì)胞）浸潤(rùn)，肺損傷程度嚴(yán)重；而T組肺泡擴(kuò)張、水腫明顯，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，肺損傷程度較M組減輕。
　　(3)RT-PCR方法檢測(cè)海水淹溺后家兔AM內(nèi)TNF-αmRNA的表達(dá)即開始上升，隨時(shí)間增加逐漸增高.90分鐘左右達(dá)到高峰，之后輕微下降，但仍明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。C組AM中TNF-αmRNA僅有輕微表達(dá)，M組顯著升高（P<0.01）：T組顯

11、著低于M組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兔PO2、PH進(jìn)行性下降，提示肺換氣功能受損嚴(yán)重，符合ALI/ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)，表明海水淹溺致急性肺損傷兔模型構(gòu)建成功。
　　2．SW-RDS家兔肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-amRNA的表達(dá)水平在模型建立后即開始升高（P<0.01），說明SW-RDS原因可能與肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA高表達(dá)有關(guān)；對(duì)SW-RDS動(dòng)物模型AM中TNF-αmRNA的動(dòng)態(tài)分析，提