燒傷后皮膚組織修復再生的基礎與臨床研究（汗腺再生及燒傷后化膿性肉芽腫診療）.pdf

1、目的:1.探索人外分泌汗腺的自發(fā)熒光發(fā)生機制;2.篩選與人骨髓間充質干細胞(MSCs)轉分化為汗腺樣細胞過程密切相關基因啟動子位點，探索DNA甲基化調控MSCs的轉分化機制;3.回顧分析燒傷后化膿性肉芽腫病例特點，比較燒傷后化膿性肉芽腫與經典化膿性肉芽腫的不同，優(yōu)化燒傷后化膿性肉茅腫的診斷和治療技術。
　　方法:1.全厚皮膚組織樣本來自5例志愿者，用熒光顯微鏡觀察人皮膚組織石蠟切片HE染色后外分泌汗腺自發(fā)熒光，并與間接免疫熒光方法

2、比較;提取外分泌汗腺，置于熒光顯微鏡鏡下觀察自發(fā)熒光，采用激光共聚焦掃描顯微鏡測量貼壁后汗腺自發(fā)熒光強度。2.熱休克汗腺誘導MSCs共培養(yǎng)10d，間接免疫熒光技術檢測MSCs轉分化后KRT19和CEA標志，用RT-PCR和Western blots檢測誘導MSCs分化0d、5d和10d后CEA基因和蛋白表達情況。芯片檢測MSCs分化前后45萬個基因位點DNA甲基化水平變化。從甲基化水平顯著變化基因位點中，篩選出與MSCs轉分化密切相關基

3、因位點。用飛行質譜技術檢測關鍵基因啟動子的甲基化水平在誘導分化前后的水平變化;篩選出的關鍵基因構建質粒并轉染MSCs并培養(yǎng)，分為三組，D組Pax6轉染組用MSCs培養(yǎng)基，E組未轉染MSCs培養(yǎng)基內加入10ng/μL5-Azd，F組Pax6轉染MSCs培養(yǎng)基內加入10ng/μL5-Azd。應用RT-PCR和Western blot檢測轉染5天CEA基因和蛋白表達。3.收集2003年至2013年燒傷后化膿性肉芽腫患者診治資料，納入標準為資料

4、完整，并且隨訪時間大于6個月。排除標準為資料不完整，或隨訪時間不足6個月或者失訪。
　　結果:1.HE染色后切片存在自發(fā)熒光現象，在藍光(470/40 nm)下呈現綠色熒光，在綠光(515-560 nm)下呈現紅色熒光，在紫外光(340-380 nm)下呈現藍色熒光。這種自發(fā)熒光與間接法免疫熒光比較具有不衰減、操作簡單和成本低的特點;游離外分泌汗腺自發(fā)熒光在藍光(430-500)下表現為綠色，在綠光(500-560nm)下表現為紅

5、色，在紫外光(小于430nm)下表現為藍色，488nm激光激發(fā)光譜分析有兩個峰值。一個峰值位于530nm，熒光強度為11.54±4.66;另一個位于590nm，熒光強度為10.38±4.33。2.MSC經共培養(yǎng)10d后KRT19和和CEA免疫熒光染色示陽性，對照組KRT19和CEA示陰性。芯片檢測MSC誘導分化前后共有76個基因位點的DNA甲基化水平具有明顯差異(0.169‰)，甲基化水平明顯降低51個位點，其中SLC12A7、ENKU

6、R、LRWD1、Pax6和HDAC4等位點甲基化水平顯著下降。甲基化水平明顯升高25個位點，其中Hoxd11、ADARB2、ANGPT1、UNC84A和BMP6等位點DNA甲基化水平明顯升高。提示MSC轉分化過程中DNA甲基化水平以下調為主。經過比較分析，選擇Pax6基因位點進行飛行質譜檢測，結果提示該位點甲基化水平明顯降低。質粒構建Pax6轉染MSCs，培養(yǎng)5天僅F組CEA基因表達明顯增高，CEA蛋白陽性表達。3.本研究納入共15例患

7、者，男女比例為10∶5。年齡范圍自1歲到58歲，均曾有Ⅱ度燒傷。分布于面頸部、軀干和四肢等。保守治療和手術治療均能治愈PGB。保守治療需要43.9±8.65天，手術治療患者住院時間21±2.74天，兩者相比較P＜0.01。11例患者創(chuàng)面培養(yǎng)細菌或者真菌陽性。10例保守治療自愈。3例全層切除，其中2例切除植皮，1例切除直接縫合。2例刮除手術。14例患者無復發(fā)，僅1例刮除手術后7天復發(fā)，經創(chuàng)面換藥后自愈。
　　結論:1.外分泌汗腺自發(fā)