長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激豬組織損傷與hsps mRNA轉(zhuǎn)錄、HSPs表達(dá)相關(guān)性研究.pdf

1、應(yīng)激是機(jī)體受到應(yīng)激性刺激后所產(chǎn)生的一種非特異性反應(yīng)，適當(dāng)?shù)膽?yīng)激對(duì)機(jī)體有利，但是過(guò)強(qiáng)或維持時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的應(yīng)激可以造成組織和器官的病理性損傷，甚至導(dǎo)致動(dòng)物猝死。運(yùn)輸應(yīng)激每年為世界經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失，且目前國(guó)際上對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激沒(méi)有統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)激時(shí)，組織細(xì)胞中的熱休克蛋白(HSPs)的含量會(huì)發(fā)生急劇變化，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡，幫助細(xì)胞耐過(guò)生物逆境。本試驗(yàn)將在相同環(huán)境中飼養(yǎng)的18頭出欄育肥豬隨機(jī)均分為A～F等6組，每組3 頭。試驗(yàn)當(dāng)日，對(duì)照組豬(A組

2、)處于正常飼養(yǎng)環(huán)境，其他各試驗(yàn)組豬用動(dòng)物運(yùn)輸車 輛務(wù)別進(jìn)行1h(B組)、2h(C組)、4h(D組)、6h(E組)和10h(F組)的運(yùn)輸應(yīng)激，路途運(yùn)輸模擬國(guó)內(nèi)普通等級(jí)公路的運(yùn)輸狀況(當(dāng)時(shí)室外溫度為18-25℃)，速度控制在50-60km．h<'-1>，整個(gè)運(yùn)輸過(guò)程沒(méi)有飲水和喂食。對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激到試驗(yàn)設(shè)定時(shí)間的試驗(yàn)組豬進(jìn)行及時(shí)剖殺，采取血液，分離血清用于肌酸激酶(CK)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的檢測(cè)；采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)等組

3、織一份，固定于10％中性福爾馬林溶液中，用于病理組織學(xué)觀察和Hsp27、Hsp70以及Hsp90的免疫組織化學(xué)檢測(cè)；同樣兩份組織樣品用液氮速凍后，凍存于-70℃冰箱，用于hsp70mRNA和hsp90mRNA定位和定量檢測(cè)，探討長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激豬組織損傷與hsps mRNA轉(zhuǎn)錄、HSPs表達(dá)之間的相關(guān)性。 利用組織學(xué)以及臨床病理學(xué)等方法，研究長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)育肥出欄豬組織的應(yīng)激性損傷。結(jié)果表明：長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激初期(1～2h)，反映組織損傷的肌

4、酸激酶(CK) 和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)在血液中的含量都顯著升高(P＜O.05)；運(yùn)輸應(yīng)激4h時(shí)，CK 及AST活性有所下降，和對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)；而當(dāng)運(yùn)輸應(yīng)激持續(xù)到6h 和10h時(shí)，CK和AST活性又顯著升高。組織學(xué)觀察，在長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激初期(1～2 h)， 所檢組織均出現(xiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、細(xì)胞急性腫脹等急性病理性損傷變化,損傷程度 較為嚴(yán)重；運(yùn)輸應(yīng)激4h時(shí)，各組織的病理?yè)p傷與應(yīng)激初期相似，但血管的充血程度

5、有所減輕；運(yùn)輸應(yīng)激持續(xù)到6～10 h時(shí)，各組織尤其心肌纖維的損傷程度進(jìn)一步加劇。 長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激可以導(dǎo)致組織細(xì)胞應(yīng)激性損傷，并且組織的損傷程度隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)有所波動(dòng)。 利用免疫組織化學(xué)方法，研究HsPs在長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激育肥豬組織細(xì)胞中的分布。結(jié)果顯示，Hsp70、Hsp90以及Hsp27在組織細(xì)胞中的定位無(wú)肉眼可見(jiàn)的隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生的相應(yīng)變化，但是不同的HSPs在組織細(xì)胞中的分布有較大差異。Hsp70在肺臟細(xì)支氣管粘膜

6、層、心肌纖維胞漿、肝細(xì)胞的胞漿和胞核、淋巴結(jié)和脾臟的血管壁、背最長(zhǎng)肌纖維的胞漿和部分胞核以及腎小管上皮細(xì)胞的胞漿和部分胞核中均有強(qiáng)陽(yáng)性著色；Hsp90在肺臟細(xì)支氣管粘膜層、心肌纖維和肝細(xì)胞的胞漿、淋巴結(jié)和脾臟中的血管壁以及部分淋巴細(xì)胞、背最長(zhǎng)肌纖維的胞漿和部分胞核以及部分腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中高表達(dá)；Hsp27在肺臟細(xì)支氣管的粘膜下層、心肌纖維和肝細(xì)胞胞漿、背最長(zhǎng)肌纖維的胞漿和胞核以及受檢組織的血管壁及內(nèi)皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

7、根據(jù)hsp70和hsp90 mRNA的基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物，將PCR擴(kuò)增的基因片段克隆到pGEM-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定，利用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，制作RNA探針，建立檢測(cè)lasps mRNA的原位雜交方法。利用自建的原位雜交方法，對(duì)lasp70 mRNA、hs090 mRNA進(jìn)行組織細(xì)胞定位，探討hsps mRNA組織細(xì)胞定位與HSPs組織細(xì)胞定位以及運(yùn)輸應(yīng)激造成的組織損傷之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：hsp70 mRNA和hsp90mR

8、NA廣泛分布于各組織細(xì)胞中，尤其在細(xì)胞核中相對(duì)集中，在腎小管上皮細(xì)胞胞漿中也呈強(qiáng)陽(yáng)性著色。 根據(jù)hsp70、hsp90和GAPDH mRNA的基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物，將PCR擴(kuò)增的基因片段克隆到pGEM-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定，體外轉(zhuǎn)錄出RNA，梯度稀釋作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和樣品檢測(cè)，建立了一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)平臺(tái)，并對(duì)其有效率、敏感性、特異性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證明，我們建立的一步法實(shí)時(shí)熒光定量

9、RT-PCR技術(shù)平臺(tái)可以真實(shí)的反映反應(yīng)管中模板的數(shù)量，可以用于mRNA水平的檢測(cè)。利用自建的豬hsps mRNA熒光定量RT-PCR技術(shù)平臺(tái)，對(duì)長(zhǎng)途運(yùn)輸豬各組織中hsp70和hsp90 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，探討長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激豬組織損傷與各組織中hsps mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性，為hsps mRNA作為機(jī)體應(yīng)激的生物標(biāo)識(shí)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。經(jīng)1、2、4、6和10 h的運(yùn)輸應(yīng)激后，所檢組織中hsp70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著運(yùn)輸應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)

10、呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，運(yùn)輸應(yīng)激到10 h時(shí)，hsp70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在肝臟、心臟、肺臟、淋巴結(jié)、腎臟和背最長(zhǎng)肌組織中分別為對(duì)照組的2.5、4.1、23、9.6、14.2和5.1倍；hsp90 mRNA在不同組織中隨著運(yùn)輸應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)其變化趨勢(shì)波動(dòng)較大。運(yùn)輸應(yīng)激可以影響hsps mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，并且對(duì)不同家族的hsps mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響不同。hsp70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著運(yùn)輸應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)一直上升，可作為豬運(yùn)輸應(yīng)激的

11、生物標(biāo)識(shí)之一。 準(zhǔn)確稱量組織樣品，進(jìn)行組織研磨、勻漿、低溫離心，SDS-PAGE電泳，利用單 克隆抗體建立間接法HSPs Western blotting檢測(cè)方法；并通過(guò)組織勻漿液點(diǎn)硝酸纖維素膜，建立間接法HSPs Dot blotting檢測(cè)方法，并對(duì)兩種方法進(jìn)行了比較。Westernblotting檢測(cè)方法可以通過(guò)SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量分開(kāi)，通過(guò)單抗識(shí)別、灰度分析，對(duì)特種蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，但是需要進(jìn)行