子宮肌瘤動(dòng)物模型細(xì)胞凋亡及其調(diào)控因素的研究.pdf

1、子宮肌瘤是婦科常見(jiàn)疾病，發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，至少有25﹪生育期女性有明顯的臨床癥狀，手術(shù)標(biāo)本病理檢查診斷率可達(dá)77﹪，嚴(yán)重影響女性的身心健康。子宮肌瘤確切的發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，現(xiàn)已研究證明有多種因素參與了肌瘤的生長(zhǎng)，其中細(xì)胞凋亡受抑制是主要的影響因素之一，在眾多凋亡基因中，bcl-2和bax表達(dá)與子宮肌瘤細(xì)胞凋亡異常最為密切。 腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究表明，細(xì)胞凋亡受抑制在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其中bcl-2基因家族

2、在調(diào)控細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵性作用。bcl-2家族由一系列與bcl-2同源的基因組成，目前共發(fā)現(xiàn)15個(gè)家族成員，他們分別對(duì)細(xì)胞凋亡起著促進(jìn)或抑制作用，bcl-2和bax是其中最重要的凋亡正負(fù)調(diào)節(jié)基因。bcl-2是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳類凋亡調(diào)控基因，其生物學(xué)功能是延長(zhǎng)細(xì)胞壽命并抑制多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而bax能拮抗bcl-2的作用，其表達(dá)增多時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。bcl-2家族成員相應(yīng)的蛋白自身或彼此之間能形成二聚體，蛋白-蛋白的相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞的

3、存活與凋亡，以bcl-2和bax的相互作用為中心。bcl-2與bax的二聚體使bcl-2失去抑制細(xì)胞死亡的功能，因此兩者在細(xì)胞內(nèi)的比例是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因素之一。細(xì)胞凋亡與增殖是細(xì)胞最重要的生命活動(dòng)現(xiàn)象，以往認(rèn)為是兩個(gè)完全互不相關(guān)的過(guò)程，目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡與增殖既相互聯(lián)系又相互制約并受到一系列信號(hào)及其傳導(dǎo)機(jī)制的調(diào)控，細(xì)胞凋亡和增殖平衡的失調(diào)是腫瘤發(fā)生的重要原因。細(xì)胞增殖加強(qiáng)而凋亡速度減慢，或應(yīng)凋亡的細(xì)胞沒(méi)有凋亡，致使細(xì)胞數(shù)目增多，也是腫瘤發(fā)

4、生的重要機(jī)制之一。 以往的研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡僅存在于惡性腫瘤中，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，屬于良性腫瘤范疇的子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。自1997年Matsuo等首次報(bào)道子宮肌瘤患者肌瘤內(nèi)bcl-2表達(dá)在分泌期高于增生期以來(lái)(孕激素(P)水平分泌期高于增生期)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)子宮肌瘤中細(xì)胞凋亡基因及其與性激素關(guān)系進(jìn)行了研究。李衛(wèi)平等報(bào)道肌瘤內(nèi)bcl-2mRNA增多，baxmRNA減少，bcl-2/baxmRNA增大；肌瘤內(nèi)雌

5、激素受體(ER)和孕激素受體(PR)與bcl-2/baxmRNA呈正相關(guān)，其中PR與bcl-2/baxmRNA的相關(guān)性更強(qiáng)。目前研究認(rèn)為，子宮肌瘤雖然是良性腫瘤，但也存在細(xì)胞凋亡異常現(xiàn)象。性激素對(duì)子宮肌瘤一方面通過(guò)某些機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖，另一方面雌激素(E)、P尤其是P通過(guò)調(diào)控調(diào)亡基因bcl-2或bcl-2/bax抑制細(xì)胞凋亡，從而間接刺激肌瘤細(xì)胞數(shù)目增多，這是肌瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。 動(dòng)物模型是研究人類疾病發(fā)生機(jī)制及其治療方

6、法的重要手段。相對(duì)于臨床研究，子宮肌瘤動(dòng)物模型研究的報(bào)道很少，但是有逐年增加的趨勢(shì)。目前國(guó)外應(yīng)用的子宮肌瘤動(dòng)物模型主要有三種，外源性性激素給予豚鼠模型，轉(zhuǎn)基因小鼠模型和自發(fā)性Eker大鼠模型。國(guó)內(nèi)由于條件所限，只使用其中外源性性激素給予的子宮肌瘤動(dòng)物模型。該模型雖存在造模時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，但其病理組織學(xué)表現(xiàn)與人類疾病有較大的相似性，有一定的應(yīng)用價(jià)值。豚鼠是國(guó)內(nèi)外外源性性激素造模的首選動(dòng)物，國(guó)內(nèi)除豚鼠外，還常選用大鼠。 子宮肌瘤模型動(dòng)

7、物細(xì)胞凋亡及其調(diào)控因素的研究未見(jiàn)公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)，大鼠和豚鼠做為子宮肌瘤動(dòng)物模型的差異性未見(jiàn)報(bào)道。因此，本論文在外源性性激素致豚鼠及大鼠子宮肌瘤模型的基礎(chǔ)上，對(duì)模型動(dòng)物中細(xì)胞凋亡及其調(diào)控因素進(jìn)行研究，探討模型與臨床疾病的相關(guān)性；同時(shí)探討大鼠和豚鼠做為子宮肌瘤模型動(dòng)物的差異性。 1目的在復(fù)制的大鼠及豚鼠子宮肌瘤模型基礎(chǔ)上，對(duì)模型動(dòng)物中細(xì)胞凋亡及其調(diào)控因素進(jìn)行研究，探討動(dòng)物模型與臨床的相關(guān)性；同時(shí)探討大鼠和豚鼠做為子宮肌瘤動(dòng)物模型

8、的差異性。 2方法肌注雌二醇(E2)3個(gè)月加注孕激素(P)1個(gè)月分別復(fù)制子宮肌瘤大鼠和豚鼠模型。細(xì)胞凋亡研究包括細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞凋亡生化特征觀察和凋亡基因bcl-2和bax測(cè)定。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)通過(guò)子宮石蠟切片HE染色光學(xué)顯微鏡觀察。利用動(dòng)物基因DNA快速提取試劑盒提取子宮組織DNA，對(duì)提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察細(xì)胞凋亡時(shí)染色質(zhì)DNA斷裂的生化特征。bcl-2和bax的測(cè)定，大鼠模型采用免疫組

9、織化學(xué)SABC法，豚鼠模型采用ELISA法。在豚鼠模型中分別測(cè)定子宮體部和分角根部bcl-2和bax表達(dá)，并計(jì)算其比值。細(xì)胞凋亡調(diào)控因素研究包括血清E2、P水平測(cè)定，子宮大體形態(tài)學(xué)和病理形態(tài)學(xué)觀察。血清E2、P水平測(cè)定方法采用放射免疫分析法，并分析E2、P水平與bcl-2、bax、bcl-2/bax的相關(guān)性。子宮大體形態(tài)學(xué)觀察包括子宮重量、直徑及肉眼觀，子宮病理形態(tài)學(xué)觀察包括子宮平滑肌厚度等。 3結(jié)果3.1細(xì)胞凋亡研究3.1.1

10、細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察大鼠和豚鼠模型中，子宮平滑肌層未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，子宮內(nèi)膜偶爾可見(jiàn)散在分布的凋亡細(xì)胞，核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色，核染色質(zhì)致密濃縮、碎裂等。 3.1.2細(xì)胞凋亡生化特征觀察大鼠模型子宮組織DNA電泳結(jié)果出現(xiàn)一條距加樣孔很近的大分子條帶，但沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡典型生化特征“梯狀”條帶。 3.1.3凋亡基因表達(dá)的測(cè)定子宮肌瘤模型大鼠子宮切片免疫組化顯色結(jié)果顯示，模型組和空白組均可見(jiàn)棕黃色顆粒，即表示bcl-2和bax蛋

11、白的陽(yáng)性顯色。棕黃色顆粒主要出現(xiàn)在細(xì)胞漿，散在于子宮環(huán)行平滑肌層，內(nèi)膜和漿膜未見(jiàn)。利用圖象分析儀軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，模型組平滑肌bcl-2蛋白陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)目明顯增多，陽(yáng)性信號(hào)顯著增強(qiáng)，bax蛋白陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)目明顯減少，陽(yáng)性信號(hào)顯著減弱，與空白組比較均有顯著性差異。 子宮肌瘤模型豚鼠子宮勻漿ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組子宮體部和根部組織的bcl-2表達(dá)明顯增多，bax表達(dá)明顯減少，bcl-2/bax比值明顯增大

12、；模型組子宮根部與體部相比，各指標(biāo)均沒(méi)有顯著性差異。 3.2凋亡調(diào)控因素的研究3.2.1血清E2、P水平模型大鼠血清激素水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，E2水平明顯升高，P水平有升高趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異，E2/P比值明顯增大。 模型豚鼠血清激素水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，E2水平明顯升高，P水平和E2/P比值有升高趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。P水平與子宮體部bcl-2/bax比值呈正相關(guān)。 3.2.2子宮大

13、體形態(tài)3.2.2.1子宮重量及分角根部橫、豎徑與空白組比較，模型大鼠和豚鼠子宮重量及其系數(shù)明顯增大；子宮分角根部橫、豎直徑明顯增大。 3.2.2.2子宮肉眼觀察與空白組相比，模型大鼠子宮明顯增粗，根部明顯腫脹。 與空白組相比，模型豚鼠子宮明顯增粗，根部明顯腫脹。漿膜面充血淤血，顏色不均勻。 3.2.3子宮組織形態(tài)學(xué)觀察與空白組比較，大鼠子宮平滑肌明顯增厚，平滑肌束明顯增粗，平滑肌細(xì)胞明顯增多，大小不均，核濃染。

14、 與空白組比較，豚鼠子宮平滑肌明顯增厚，平滑肌束明顯增粗，排列不規(guī)則，散在漩渦狀結(jié)構(gòu)，平滑肌細(xì)胞明顯增多，胞漿、胞核體積比失調(diào)，大小不均，核濃染。 3.3動(dòng)物模型成功標(biāo)志的比較相同點(diǎn)：大鼠和豚鼠模型均可見(jiàn)，血清E2水平明顯升高；子宮重量增大；子宮分角根部明顯腫大、增粗；子宮平滑肌層明顯增厚，肌束明顯增粗；平滑肌細(xì)胞明顯增多。 異同點(diǎn)：豚鼠較大鼠子宮分角根部腫脹明顯，子宮漿膜面明顯充血淤血；豚鼠子宮肌束排列明顯不規(guī)則