性激素替代療法的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、雌激素是維持女性生理和心理健康所必需的內(nèi)源性活性物質(zhì)，自絕經(jīng)期開始至絕經(jīng)后，伴隨著刺激素水平的降低，女性出現(xiàn)一系列的絕經(jīng)近期、中期和遠(yuǎn)期的相關(guān)疾病。因而，雌激素補(bǔ)充治療成為女性健康醫(yī)療服務(wù)的一個(gè)重要領(lǐng)域。但是雌激素有促使子宮內(nèi)膜增生而致癌的不良反應(yīng)，所以目前主要采用雌、孕激素聯(lián)合應(yīng)用的性激素替代療法(Hormone Replacement Therapy，HRT)。但是HRT仍然存在一些不良作用，孕激素不能完全糾正雌激素的副作用，而且削

2、弱雌激素對(duì)心血管的保護(hù)作用。新的治療方案在不斷探索中。雷洛昔芬是一種選擇性的雌激素受體拮抗劑，對(duì)乳腺、子宮組織顯示為雌激素的受體拮抗劑，對(duì)骨骼和血脂則為雌激素受體的激動(dòng)劑，對(duì)心血管系統(tǒng)目前也發(fā)現(xiàn)多種類雌激素的作用。可以推測(cè)，兩者聯(lián)用后的有利作用可以得到增強(qiáng)，而二者的副作用則可以相互削減。 目前，有關(guān)新的HRT方案的研究不多，用雷洛昔芬代替孕激素的方法還沒有報(bào)道。本文應(yīng)用雷洛昔芬替代孕激素，輔以阿司匹林，觀察其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的

3、增殖以及ICAM-1、PAI-1、ET-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)的影響，從細(xì)胞和分子水平對(duì)該方案能否達(dá)到預(yù)期效果進(jìn)行深入研究。 第一部分阿司匹林抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及相關(guān)機(jī)制 方法： 1.MTT法檢測(cè)對(duì)血管平滑肌增殖的抑制作用將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔10<'4>個(gè)種于96孔板中，待其長至80﹪融合，換用不含血清和酚紅的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞同步于G<,0>期，然后換用2﹪FCS的：DMEM，加入阿

4、司匹林，使終濃度分別為10<'-4>4mol/L、10<'-3>3mol/L、2×10<'-3>mol/L、5×10<'-3>mol/L四個(gè)處理組，并設(shè)對(duì)照組。培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入MTT(0.5/L)20ul孵育4小時(shí)，吸去上部液體，然后加入二甲基亞砜(DMSO)150ul，輕微震蕩10min使沉淀完全溶解，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測(cè)定吸光度。觀察阿司匹林對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖的抑制作用。 2．免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)阿司匹林處理

5、后平滑肌細(xì)胞中PCNA表達(dá)用VSMC制作細(xì)胞爬片，將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以每孔10<'5>個(gè)接種于6孔板中，蓋玻片預(yù)先放置在6孔板中，待長至80﹪融合時(shí)用無血清無酚紅DMEM靜止24小時(shí)，換含2﹪FCS的DMEM，加入阿司匹林，分組同上。24小時(shí)后，移去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，4﹪多聚甲醛固定，PBS洗3次，用試劑盒中的山羊血清室溫孵育30min，加一抗置濕盒中4℃孵育12小時(shí)，然后按照試劑盒說明書加二抗，顯色，復(fù)染。在100倍視野下隨機(jī)選取

6、細(xì)胞爬片上不同部位的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。用x<'2>檢驗(yàn)、Fisher’s精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。 3．流式細(xì)胞檢測(cè)阿司匹林作用后血管平滑肌細(xì)胞周期變化細(xì)胞按10<'5>個(gè)細(xì)胞每孔轉(zhuǎn)入6孔L板培養(yǎng)至80﹪融合，更換為無血清培養(yǎng)基孵育24h使細(xì)胞同步，隨后將細(xì)胞置于含2﹪FCS培養(yǎng)基中，并加入不同劑量阿司匹林(分組為10<'-3>mol/L、2×10<'-3>mol/L、5×10<'-3>mo

7、l/L三個(gè)處理組和對(duì)照組)，繼續(xù)孵育24h，收獲細(xì)胞(約10<'6>個(gè))，70﹪乙醇固定，4℃過夜，溴化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。Modtif軟件分析細(xì)胞周期。 4．RT-PCR檢測(cè)阿司匹林作用后PCNA mRNA表達(dá)變化細(xì)胞經(jīng)不同濃度阿司匹林(分組同上)處理24小時(shí)后，用Trizol提取總RNA，具體操作步驟按照說明書。用紫外分光光度法測(cè)定RNA純度和濃度。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定PCNA mRNA表達(dá)，用β-actin作為

8、內(nèi)參。按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，PCNA和β-actirin同管在50ul反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在含0.5ug，ul EB的1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-rad)對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析，PCNA基因的表達(dá)量通過擴(kuò)增的β-actin的表達(dá)進(jìn)行校正，即以PCNA/β-actin比值作為PCNA基因表達(dá)相對(duì)水平．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，采用SPSS

9、10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)、方差分析、x<'2>檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果： 1.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示阿司匹林能明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性，在各濃度的生長抑制率分別為4.9﹪、15.5﹪、16.2﹪、31.5﹪。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)顯示5×10<'-3>mol/L，阿司匹林處理組染色較淺，而對(duì)照組和10<'-3>mol/L、2×10<'-3>mol/L組染色深。軟件檢測(cè)后結(jié)果顯示5×10<'-3>mol

10、/L組PCNA表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而10<'-3>mol/L、2×10<'-3>mol/L，組和對(duì)照組間沒有明顯差異(P>0.05). 3.流式細(xì)胞結(jié)果表明5×10<'-3>mol/L阿司匹林處理后，血管平滑肌細(xì)胞增殖主要阻滯在S期。 4.5×10<'-3>mol/L阿司匹林處理后，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)PCNA mRNA表達(dá)較對(duì)照組低。而10<'-3>mol/L和2×10<'-3>mol/L濃度和對(duì)照組間

11、沒有明顯差異。 結(jié)論： 本文證明較高濃度的阿司匹林能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和核內(nèi)PCNA的表達(dá)，提示這種抑制作用可能是通過抑制PCNA的表達(dá)，從而使血管平滑肌細(xì)胞的增殖停滯在S期。阿司匹林抑制PCNA表達(dá)最早可能在mRNA水平。 第二部分單一藥物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1、PAI-1、ICAM-1基因表達(dá)的影響 方法：將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以每孔10<'5>個(gè)接種于6孔板中，待其長至70-80﹪融合，換含1﹪

12、血清無酚紅的培養(yǎng)液培養(yǎng)。加入藥物，培養(yǎng)24小時(shí)后取出細(xì)胞，按Tizol說明書提取RNA，做逆轉(zhuǎn)錄PCR，檢測(cè)雌激素，雷洛昔芬，阿司匹林處理后，ET-1、PAI-1、ICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。 三種藥物的實(shí)驗(yàn)分組情況分別為：阿司匹林：5×10<'-3>mol/L，2×10<'-3>mol/L，10<'-3>mol/L，對(duì)照組雌激素：10<'-9>mol/L，10<'-8>mol/L，10<'-7>mol/L，對(duì)照組。雷洛

13、昔芬：10<'-8>mol/L，10<'-7>mol/L，10<'-6>mol/L，對(duì)照組。 結(jié)果：5×10<'-3>mol/L阿司匹林能抑制PAI-1基因表達(dá)10<'-7>mol/L和10<'-6>mol/L雌激素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1基因的表達(dá)10<'-6>mol/L雷洛昔芬可以抑制ICAM-1和ET-1基因的表達(dá)。 結(jié)論：較高濃度的雌激素和雷洛昔芬可以抑制ET-1表達(dá)，阿司匹林可以抑制PAI-1表達(dá)，而這兩個(gè)內(nèi)