一氧化氮與舌鱗狀細(xì)胞癌放化療敏感性研究.pdf

1、一氧化氮(Nitric oxide，NO)作為一種重要的生物活性分子，其抗腫瘤特性已經(jīng)越來越得到重視。NO參與體內(nèi)一系列生理和病理?xiàng)l件下的生物過程，調(diào)節(jié)循環(huán)、神經(jīng)、免疫等一系列生理活動(dòng)，如血管擴(kuò)張、血管通透性、血小板粘附和聚集、神經(jīng)信號(hào)傳遞、宿主防御反應(yīng)等，同時(shí)也參與包括腫瘤在內(nèi)的病理過程，在腫瘤生物學(xué)上的作用錯(cuò)綜復(fù)雜。 綜合而言，NO具有幾個(gè)方面的量效效應(yīng)：生理情況下，對(duì)正常細(xì)胞來說，適量水平的NO在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)體防御和抗基因

2、突變方面有重要的生理功能，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用；而在病理狀態(tài)下，依賴于NO生成的濃度、時(shí)間和效應(yīng)部位，不同條件下在體內(nèi)具有促瘤或抗瘤兩種作用。持續(xù)低濃度的NO損傷DNA，導(dǎo)致基因突變，誘發(fā)癌變，并通過促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)等效應(yīng)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；高濃度的NO則通過產(chǎn)生細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑產(chǎn)生抗瘤效應(yīng)。內(nèi)源性NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化生成，而誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是催化精氨酸合成NO的關(guān)鍵酶。iNOs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展

3、、轉(zhuǎn)移及治療等各個(gè)方面都起到調(diào)節(jié)作用。人類腫瘤中的iNOS表達(dá)升高主要與腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有關(guān)，因?yàn)槟[瘤組織中產(chǎn)生的NO水平比NO發(fā)揮細(xì)胞毒作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)所需的NO水平至少要低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。從口腔粘膜癌前病變發(fā)展到鱗狀細(xì)胞癌過程中，iNOS表達(dá)呈上升趨勢(shì)，表明高水平NO是口腔鱗癌生長(zhǎng)的早期條件，它作為iNOS的催化產(chǎn)物，通過生成有毒代謝產(chǎn)物介導(dǎo)DNA損傷；同時(shí)促進(jìn)前列腺素PGE2的合成，促進(jìn)腫瘤血管生成、增加血管通透性。重度異常增生

4、中iNOS的高表達(dá)和強(qiáng)染色可能是其發(fā)展為侵襲性癌的促進(jìn)因素。利用NO的抗腫瘤特性來提高放療與化療的療效，是腫瘤治療的重要途徑。 本課題以人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113為研究對(duì)象，第一部分采用NO供體硝普鈉(SNP，Sodium nitroprusside)，研究不同作用濃度下外源性NO的放射增敏及凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，SNP的細(xì)胞增殖抑制作用呈時(shí)間及劑量依賴性，對(duì)Tca8113細(xì)胞有明顯的放射增敏作用，并能夠使細(xì)胞周期產(chǎn)生

5、G2／M期阻滯。SNP的細(xì)胞增殖抑制作用及放療增敏作用通過細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)，可能與Caspase細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。但采用NO供體藥物，模擬體內(nèi)高濃度NO的研究手段僅限于體外實(shí)驗(yàn)，隨著NO濃度的增加，對(duì)機(jī)體的損傷也逐漸加大，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的低血壓，甚至危及生命，而且存在耐藥性、全身不良反應(yīng)等毒副作用，甚至可能增加腫瘤血供和供氧，有潛在的促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的危險(xiǎn)，使其應(yīng)用受到一定限制。在第一部分研究工作的基礎(chǔ)上，第二部分課題采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將攜帶

6、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)基因的質(zhì)粒導(dǎo)入人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113中，提供既增加NO產(chǎn)量，又避免發(fā)生全身毒副反應(yīng)的NO供體方法，研究細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的有效性及轉(zhuǎn)染前后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。 研究結(jié)果顯示，iNOS基因轉(zhuǎn)染使Tca8113細(xì)胞穩(wěn)定且高表達(dá)iNOS，增加NO含量，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖，并使細(xì)胞周期產(chǎn)生G2／M期阻滯。第三部分在前兩部分工作基礎(chǔ)上進(jìn)一

7、步探討iNOS基因成功轉(zhuǎn)染后，Tca8113細(xì)胞化療及放療敏感性的改變及初步機(jī)理。 第一部分硝普鈉聯(lián)合直線加速器協(xié)同誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究研究外源性一氧化氮供體SNP對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113細(xì)胞的增殖抑制作用，以及聯(lián)合直線加速器放療的凋亡誘導(dǎo)作用。采用M7T法觀察不同濃度和不同作用時(shí)間的SNP對(duì)Tca8113細(xì)胞的增殖抑制作用，并進(jìn)行不同SNP作用濃度下的細(xì)胞周期分析。同時(shí)，對(duì)比研究單純應(yīng)用SNP，單純放療及兩者

8、聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Tca8113細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用:HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Hoechest33258染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化，DNA凝膠電泳及Annexin-V／PI雙標(biāo)記等分析細(xì)胞凋亡。Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)，同時(shí)采用流式細(xì)胞儀分析活性Caspase-3的表達(dá)情況。 結(jié)果顯示：不同濃度(0.1，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mmol／L)的SNP對(duì)Tca8

9、113細(xì)胞均有抑制作用，但0.1mmol/L的小劑量作用12h，24h后，雖然細(xì)胞的存活率有所下降，分別為96.61％和89.64％，但和同一時(shí)間段對(duì)照組Tca81 13細(xì)胞比較無顯著性差異(P>0.05)。隨著濃度升高及作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯下降，大劑量的5mmol／L即使只作用12h，細(xì)胞的存活率也只有19.53％，作用24h的IC50約為2mmol／L。不同劑量SNP使用后，在各個(gè)放射劑量下，細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較均明顯下降

10、，而且呈濃度依賴性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：SNP在體外對(duì)Tca8113細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)，其細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為濃度依賴性和時(shí)間依賴性；SNP能夠使細(xì)胞周期發(fā)生變化，產(chǎn)生G2／M期阻滯；SNP對(duì)Tca8113細(xì)胞有放射增敏作用；其細(xì)胞毒性效應(yīng)用及放療增敏作用通過細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)，與Caspase細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。 第二部分誘導(dǎo)性一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌增殖的影響第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性NO供體SNP具有

11、細(xì)胞增殖抑制作用，對(duì)Tca8113細(xì)胞有明顯的放射增敏作用。利用iNOS基因能上調(diào)iNOS蛋白的表達(dá)而且增加NO生成的原理，第二部分采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將真核表達(dá)載體pCMV-iNOS轉(zhuǎn)染入舌癌細(xì)胞系Tca8113，得到高表達(dá)iNOS的細(xì)胞系pCMV-iNOS-Tca，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞系pCMV-Tca，用正常的Tca8113細(xì)胞作為對(duì)照，以Western blot方法鑒定轉(zhuǎn)染效果；Griess法測(cè)定NO濃度，以鑒定iNOS基因的

12、功能狀態(tài)；倒置顯微鏡及HE染色進(jìn)行轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法分析iNOS基因轉(zhuǎn)染對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響并繪制生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后對(duì)細(xì)胞周期的影響及計(jì)算增殖指數(shù)。 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，pCMV-Tca組和Tca8113對(duì)照組iNOS蛋白均有表達(dá)，但基礎(chǔ)水平較低，兩者表達(dá)量近似。pCMV-iNOS-Tca組iNOS蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，說明轉(zhuǎn)染iNOS基因后細(xì)胞獲得正常表

13、達(dá)iNOS蛋白的功能；Griess法轉(zhuǎn)染前后培養(yǎng)不同時(shí)間，細(xì)胞培養(yǎng)上清液的NO含量檢測(cè)結(jié)果表明，三組細(xì)胞NO含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)都逐步升高，但pCMV-iNOS-Tca組在培養(yǎng)12h時(shí)NO含量就明顯升高，達(dá)153.45±26.23μmol/L，而Tca8113組和pCMV-Tca組分別只有28.18±7.44和34.45±9.67μmol／L，各個(gè)檢測(cè)時(shí)間段都明顯低于iNOS轉(zhuǎn)染組，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異(P<0.001)，而Tca8

14、113組和pCMV-Tca之間各個(gè)時(shí)間段比較都無顯著性差異(P＞0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量增高，證明iNOS基因有分泌一氧化氮的功能，轉(zhuǎn)染有效。 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，結(jié)果表明：pCMV-iNOS-Tca組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度快于pCMV-Tca組和Tea8113組，但第1d及第2d三組之間并無顯著性差異(P＞0.05)；從第3d起，pCMV-iNOS-Tca組細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，與后兩組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

15、而pCMV-Tea組和Tea8113組兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相近，兩組各個(gè)時(shí)間段的吸光度值比較均無顯著性差異(P＞0.05)。 以上結(jié)果說明，iNOS基因轉(zhuǎn)染使Tca8113細(xì)胞穩(wěn)定且高表達(dá)iNOS蛋白，增加NO分泌量，促進(jìn)了細(xì)胞增殖，并使細(xì)胞周期產(chǎn)生G2／M期阻滯。 第三部分iNos基因轉(zhuǎn)染對(duì)Tca8113細(xì)胞體外化放療增敏作用及其機(jī)制研究在前兩部分研究工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討iNOS基因?qū)θ松圜[狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tea8113

16、化放療增敏作用及初步機(jī)理。實(shí)驗(yàn)分三組：轉(zhuǎn)染iNOS基因的pCMV-iNOS-Tca組，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的pCMV-Tca組以及空白對(duì)照Tea8113組。采用MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染iNOS基因前后，Tca8113細(xì)胞對(duì)順鉑、氟脲嘧啶和博萊霉素等化療藥物及直線加速器放療的敏感性改變，Western blot檢測(cè)P53蛋白、P21蛋白的表達(dá)情況。 Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染iNOS基因前，Tca8113細(xì)胞無p53蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染后