人3型腺病毒六鄰體HVR1區(qū)的氨基酸修飾及其免疫特性的研究.pdf

1、目的:探討人3型腺病毒（HAdV-3）六鄰體HVR1區(qū)的氨基酸修飾及其免疫特性，為HAdV-3載體外源蛋白展示平臺(tái)技術(shù)和基因疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:以pAdΔE3GFP為模板，搭橋PCR擴(kuò)增HVR1區(qū)被修飾的六鄰體片段（含ClaI，BamHI），克隆至穿梭質(zhì)粒pBR322L/R載體上，與骨架質(zhì)粒pAdΔE3GFP在大腸桿菌 BJ5183內(nèi)同源重組后，經(jīng)AsisI酶線性化，轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，拯救包裝腺病毒。通過熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2、檢測(cè)重組腺病毒的熱穩(wěn)定性，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組腺病毒的生長(zhǎng)特性，免疫印跡（Western blot）技術(shù)檢測(cè)外源表位在六鄰體上的融合表達(dá)，ELISA分析六鄰體HVR1區(qū)融合的外源表位與標(biāo)簽單抗和免疫血清的結(jié)合活性。
　　結(jié)果:PCR及核酸序列測(cè)定結(jié)果顯示多肽flag、his6flag或 his6lgsflag成功插入至HVR1區(qū)；HVR1區(qū)可以插入長(zhǎng)度至17個(gè)氨基酸的多肽表位而不影響病毒的熱穩(wěn)定性和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性；多肽flag,

3、his6flag或his6lgsflag在六鄰體蛋白上得到表達(dá)并且暴露在病毒粒子表面；小鼠接種病毒rAd3/HVR1-flag,rAd3/HVR1-his6flag和rAd3/HVR1-his6lgsflag所產(chǎn)生的免疫血清可以分別與對(duì)應(yīng)的GST-flag，GST-his6flag和GST-his6lgsflag中融合的表位相識(shí)別。但是，rAd3/HVR1-his6flag和rAd3/HVR1-his6lgsflag組免疫的血清不能識(shí)別

4、 GST-flag和GST-his6融合蛋白。rAd3/HVR1-his6flag組免疫的血清主要是與GST-2（GST-HHHDYK）發(fā)生反應(yīng)，與其它GST所融合的表位不發(fā)生反應(yīng)；rAd3/HVR1-his6lgsflag組免疫的血清可以與GST-1（GST-HHHLGSDYK）,GST-3（GST-HHHHHHLGS）和GST-4（GST-LGSDYKDDD）發(fā)生反應(yīng)，但是與GST-his6lgsflag（GST-HHHHHHLGS