人參須骨寶對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用.pdf

1、[目的]
　　 絕經(jīng)后婦女絕大多數(shù)均易患骨質(zhì)疏松癥，是目前臨床醫(yī)學(xué)研究的重要課題，防治該病以西藥為主，但目前還沒(méi)有公認(rèn)理想的防治藥物。本課題組曾發(fā)現(xiàn)人參的有效成分人參皂苷等對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型有效。本研究將進(jìn)一步探討從人參須提取的有效成分人參須骨寶對(duì)去卵巢大鼠高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型的作用，并與陽(yáng)性對(duì)照藥物替勃龍進(jìn)行比較，觀察人參須骨寶對(duì)大鼠的骨成分、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、骨密度，骨生物力學(xué)及相關(guān)指標(biāo)的影響，為開(kāi)發(fā)人參須骨寶為抗骨質(zhì)疏松新

2、藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]
　　 藥物的制備及含量測(cè)定：按發(fā)明專(zhuān)利200810184830.9的方法制備人參須骨寶，并通過(guò)高效液相色譜法，測(cè)定人參皂苷Rb1，Rg1，Re的含量及比例。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：4.5月齡SPF級(jí)雌性未交配SD大鼠56只，隨機(jī)分成6組，基礎(chǔ)組6只，其余每組10只，除基礎(chǔ)組和假手術(shù)組外，其余全部行雙側(cè)卵巢切除術(shù)?；A(chǔ)組(Basal)未用藥，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始即處死取材；假手術(shù)組(Sham)和去

3、卵巢組(OVX)給予溶劑(蒸餾水)10ml/kg/d灌胃；陽(yáng)性藥物對(duì)照替勃龍組(Tibolone)給予替勃龍0.225mg/kg/d灌胃；人參須骨寶低劑量組(GSL)給予人參須骨寶1.66g生藥/kg/d灌胃；人參須骨寶高劑量組(GSH)給予人參須骨寶5g生藥/kg/d灌胃；每天一次，連續(xù)90d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第14天、第13天和第4天、第3天分別注射鹽酸四環(huán)素25mg/kg和鈣黃綠素5mg/kg作骨雙熒光標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，心臟取血處死大鼠

4、，收集血液，離心分離血清，測(cè)定血清血脂譜等指標(biāo)；分離右側(cè)脛骨、第4腰椎：右側(cè)脛骨上段制成不脫鈣骨切片、中段骨制成不脫鈣骨磨片，第4腰椎制成不脫鈣骨切片，分別通過(guò)半自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測(cè)量；取右側(cè)尺骨、左側(cè)股骨鹽酸消化后ICP等離子體發(fā)射光譜法測(cè)骨鈣，羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)骨羥脯氨酸含量，取右股骨及第5腰椎分別測(cè)量其骨物理指標(biāo)、骨重、骨密度(DEXA法)及骨生物力學(xué)參數(shù)(股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)、腰椎體壓縮實(shí)驗(yàn))，以此評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)大鼠骨成分

5、、骨量、骨質(zhì)量等變化；另外稱(chēng)取子宮、肝臟濕重計(jì)算子宮指數(shù)等以觀察相關(guān)臟器大體變化。
　　 [結(jié)果]
　　 1.人參須骨寶中三種人參皂苷含量及其比例
　　 本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC檢測(cè)人參須骨寶三種人參皂苷含量的方法符合高效液相色譜法定量分析的要求，人參須骨寶提取工藝穩(wěn)定。從人參須骨寶中三種人參皂苷Rb1、Rg1、Re含量測(cè)定的HPLC圖譜(圖3.4，第38頁(yè))及所擬合的各標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以換算得知人參須骨寶高劑量中Rb1

6、的含量為22.843±0.160mg/g；Rg1的含量為2.231±0.008mg/g；Re的含量為13.123±0.102mg/g，其三者比例約為10:1:6。
　　 2.去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的特點(diǎn)
　　 (1)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)
　　 ①脛骨上段松質(zhì)骨：與假手術(shù)組比較，去卵巢大鼠脛骨上段松質(zhì)骨的骨小梁面積百分率(％Tb.Ar)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)分別降低了75.5％和71.4％，骨小梁分

7、離度(Tb.Sp)、單位骨小梁周長(zhǎng)破骨細(xì)胞數(shù)(Oc.N)分別增加了3.5和2.6倍；熒光周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)(％L.Pm)、骨礦化沉積率(MAR)、骨形成率(BFR/BS、BFR/TV)分別增加了218.1％、68.0％、437.0％、50.9％。脛骨上段松質(zhì)骨骨丟失明顯，與骨吸收增強(qiáng)，偶聯(lián)骨形成增加有關(guān)。
　　 ②腰椎松質(zhì)骨：與假手術(shù)組比較，去卵巢大鼠腰椎松質(zhì)骨的％Tb.Ar和Tb.Th分別降低了41.6％和38.3％，而Tb.Sp、O

8、c.N分別增加了29.0％和204.5％；％L.Pm、MAR、骨形成率均有增加的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腰椎松質(zhì)骨骨丟失不如脛骨上段明顯。
　　 ③脛骨中段皮質(zhì)骨：與假手術(shù)組比較，去卵巢大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨的皮質(zhì)面積百分?jǐn)?shù)(％Ct.Ar)下降4.0％，骨髓面積百分?jǐn)?shù)(％Ma.Ar)增加15.6％，骨內(nèi)膜的熒光百分?jǐn)?shù)(％E-L.Pm)增加266.7％。脛骨中段皮質(zhì)骨存在骨丟失。
　　 (2)骨重量，骨鈣與骨羥脯氨酸明顯減少

9、r>　　 ①骨重量：與假手術(shù)組比較，去卵巢大鼠單位體重尺骨、股骨的干重均顯著減少(P<0.01)。
　　 ②骨成分：與假手術(shù)組比較，去卵巢大鼠股骨鈣(Ca)、羥脯氨酸(Hyp)減少(P<0.05&P<0.01)。說(shuō)明骨丟失涉及有機(jī)質(zhì)與無(wú)機(jī)質(zhì)兩方面。
　　 (3)股骨與腰椎各部位骨密度明顯減少
　　 ①股骨：股骨全段，股骨近端2cm及遠(yuǎn)端1cm BMD均顯著降低(P<0.01)。
　　 ②腰椎：腰椎全段B

10、MD顯著降低(P<0.01)。
　　 (4)骨生物力學(xué)性能明顯減弱，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加
　　 ①股骨：最大載荷、彈性載荷、斷裂載荷、剛性系數(shù)明顯下降(P<0.05&P<0.01)
　　 ②腰椎：最大載荷顯著降低(P<0.01)。
　　 (5)去卵巢大鼠體重增加，肝重減輕，血脂水平升高
　　 (6)去卵巢大鼠子宮重量減輕
　　 3.替勃龍對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響
　　 (1)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)

11、提示替勃龍有一定的預(yù)防去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用
　　 ①脛骨上段松質(zhì)骨：與去卵巢組比較，替勃龍組脛骨上段松質(zhì)骨的％Tb.Ar、Tb.N分別增加了112.3％、100.0％，但仍低于假手術(shù)組(P<0.01)，Oc.N與％Oc.Pm分別減少了81.1％、81.3％；％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/TV分別減少了52.0％、47.6％、73.3％、44.2％。替勃龍可部分預(yù)防去卵巢大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨丟失，與其抑制骨吸收、骨

12、形成，降低骨轉(zhuǎn)換有關(guān)。
　　 ②腰椎松質(zhì)骨：與去卵巢組比較，替勃龍組腰椎松質(zhì)骨的％Tb.Ar增加了21.8％，但仍低于假手術(shù)組(P<0.05)，Oc.N與Tb.Sp分別減少了78.8％、18.2％；MAR顯著減少(P<0.01)。提示替勃龍可部分預(yù)防去卵巢大鼠腰椎松質(zhì)骨骨丟失。
　　 ③脛骨中段皮質(zhì)骨：與去卵巢組比較，替勃龍組脛骨中段皮質(zhì)骨的％Ct.Ar、％Ma.Ar等無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　 (2)骨

13、重量、骨鈣增加
　　 ①骨重量：與去卵巢組比較，替勃龍組單位體重尺骨、股骨的干重均顯著增加(P<0.01)。
　　 ②骨成分：與去卵巢組比較，替勃龍組尺骨Ca增加(P<0.01)。
　　 (3)骨密度增加，股骨各部位比腰椎明顯
　　 ①股骨：股骨全段及其各部位BMD均明顯增加(P<0.01&P<0.05)
　　 ②腰椎：腰椎全段BMD變化不大(P>0.05)
　　 (4)生物力學(xué)性能恢復(fù)，

14、股骨比腰椎明顯
　　 ①股骨：最大載荷、彈性載荷、斷裂載荷、剛性系數(shù)等指標(biāo)均有所恢復(fù)(P<0.01)
　　 ②腰椎：最大載荷變化不大(P>0.05).
　　 (5)替勃龍使去卵巢大鼠體重減輕，肝重恢復(fù)，總膽固醇水平下降
　　 (6)替勃龍使去卵巢大鼠子宮重量增加
　　 4.人參須骨寶對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響
　　 (1)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)提示人參須骨寶可預(yù)防去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松
　　 ①

15、脛骨上段松質(zhì)骨：與去卵巢組比較，人參須骨寶低劑量組的％Tb.Ar、Tb.N均分別增加121.1％、100.0％；人參須骨寶高劑量組％Tb.Ar、Tb.N分別增加191.2％、145.5％，Tb.Sp、Oc.N均分別下降69.9％、66.5％，以上％Tb.Ar雖恢復(fù)仍低于假手術(shù)組(P<0.01)。人參須骨寶低劑量組％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/TV分別減少了67.3％、21.4％、74.1％、43.4％，人參須骨寶高劑量組％L

16、.Pm、MAR、BFR/BS分別減少了60.9％、31.5％、73.7％。人參須骨寶可部分預(yù)防去卵巢大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨丟失，與其抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換有關(guān)。
　　 ②腰椎松質(zhì)骨：與去卵巢組比較，人參須骨寶低劑量組的％Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均分別增加46.4％、23.4％、15.6％，Tb.Sp、Oc.N分別下降26.5％、70.9％；人參須骨寶高劑量組％Tb.Ar、Tb.N均分別增加41.7％、15.6％，Tb.Sp

17、、Oc.N分別下降24.7％、71.2％。以上骨量的恢復(fù)均能達(dá)到假手術(shù)組水平。另外兩組對(duì)動(dòng)態(tài)參數(shù)影響不大。人參須骨寶能完全預(yù)防去卵巢大鼠腰椎松質(zhì)骨的骨丟失，主要通過(guò)抑制的骨吸收活動(dòng)來(lái)恢復(fù)骨量。
　　 ③脛骨中段皮質(zhì)骨：與去卵巢組比較，人參須骨寶低劑量組Ct.Ar增加12.4％，％Ma.Ar則減少11.8％，％E-L.Pm則減少51.5％；人參須骨寶高劑量組Ct.Ar增加13.6％，％Ct.Ar、％Ma.Ar、％E-L.Pm變化不

18、明顯。人參須骨寶低劑量對(duì)去卵巢大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨丟失有較好預(yù)防作用，與其抑制內(nèi)膜高轉(zhuǎn)換率有關(guān)，高劑量則作用不明顯。
　　 (2)骨重量、骨鈣、骨羥脯氨酸增加
　　 ①骨重量：與去卵巢組比較，人參須骨寶高、低劑量使大鼠單位體重尺骨、股骨的干重均明顯增加(P<0.01&P<0.05)。
　　 ②骨成分：與去卵巢組比較，人參須骨寶高劑量能同時(shí)增加股骨Ca、Hyp含量(P<0.05)。
　　 (3)股骨、腰椎骨密

19、度增加
　　 ①股骨：人參須骨寶高、低劑量使股骨全段、股骨遠(yuǎn)端BMD均明顯增加(P<0.01&P<0.05)，但股骨近端BMD變化不大(P>0.05)。
　　 ②腰椎：人參須骨寶高、低劑量使腰椎BMD明顯增加(P<0.05)。
　　 (4)股骨、腰椎生物力學(xué)性能恢復(fù)
　　 ①股骨：人參須骨寶高、低劑量使最大載荷和彈性載荷、斷裂載荷等指標(biāo)均有所恢復(fù)(P<0.01&P<0.05)，人參須骨寶高劑量還使剛性系數(shù)

20、增加(P<0.01)。
　　 ②腰椎：人參須骨寶低劑量使最大載荷有所恢復(fù)(P<0.05)。
　　 (5)人參須骨寶不影響去卵巢大鼠體重，但使肝重恢復(fù)，血脂水平下降
　　 (6)人參須骨寶不影響去卵巢大鼠子宮重量
　　 [結(jié)論]
　　 1.人參須骨寶人參皂苷有效部位群Rb1的含量為22.843±0.160mg/g；Rg1含量為2.231±0.008mg/g；Re含量為13.123±0.102mg/g

21、，其三者比例約為10:1:6。
　　 2.4.5月齡的SD大鼠實(shí)施去卵巢手術(shù)90d后，出現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，其中，皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量均丟失，同時(shí)骨鈣與骨羥脯氨酸成分減少，骨生物力學(xué)性能減弱、骨密度減少，出現(xiàn)體重增加、血脂水平升高、子宮重量減輕等現(xiàn)象。
　　 3.替勃龍0.225mg/kg/d灌胃給藥可部分預(yù)防去卵巢大鼠脛骨上段和腰椎松質(zhì)骨的丟失，降低骨轉(zhuǎn)化率，但對(duì)脛骨中段皮質(zhì)骨預(yù)防作用不明顯；股骨骨生物力學(xué)性能、骨密度明

22、顯恢復(fù)，但對(duì)腰椎這方面影響不大；可抑制去卵巢大鼠所致的體重增加和血清總膽固醇升高；對(duì)子宮具有明顯的刺激作用，可使肝臟重量指數(shù)增加。
　　 4.1.66g生藥/kg/d(低劑量)和5g生藥/kg/d(高劑量)的人參須骨寶灌胃給藥均有效防治去卵巢大鼠高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，人參須骨寶可通過(guò)抑制骨的高轉(zhuǎn)化率，減少骨的丟失，從而增加松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨的骨量，人參須骨寶還可改善骨微觀結(jié)構(gòu)，增加骨鈣與骨羥脯氨酸的含量，增加骨密度，修復(fù)骨生物力學(xué)性能，