HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟纖維化的免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、肝臟纖維化是威脅人類健康的重大疾病。長期飲酒、脂肪肝和慢性病毒性肝炎感染是可能引起肝臟纖維化的三個重要原因。肝臟發(fā)生纖維化是許多慢性肝病發(fā)展的終末狀態(tài)，嚴(yán)重的肝臟纖維化將導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生。肝臟纖維化過程中有許多細(xì)胞參與，包括肝臟實質(zhì)細(xì)胞與非實質(zhì)細(xì)胞。其中最受關(guān)注的效應(yīng)細(xì)胞是肝臟星形細(xì)胞（hepatic stellate cell,HSC），HSC活化后分泌大量的膠原，導(dǎo)

2、致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量累積。近年也有研究發(fā)現(xiàn)，肝實質(zhì)細(xì)胞也參與了肝臟纖維化。同時，眾所周知肝臟具有天然免疫的優(yōu)勢狀態(tài)，這些在肝臟中大量存在的天然免疫細(xì)胞或多或少影響了肝臟纖維化的發(fā)展。我國擁有大量的乙肝（Hepatitis B virus,HBV）攜帶者，乙肝病毒感染是導(dǎo)致患者發(fā)生肝臟纖維化的重要原因。乙肝感染如何加速肝臟纖維化，肝臟中的免疫細(xì)胞如何參與其中尚無定論，其中一個重要原因是缺少

3、可以利用的小鼠模型。在本文研究中，我們對C57BL/6鼠和HBV轉(zhuǎn)基因（HBV-tg）鼠長期用肝臟毒物四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)肝臟纖維化，對肝臟損傷、病理學(xué)和纖維化相關(guān)分子進(jìn)行檢測，在機(jī)制研究中采用細(xì)胞群體的比例和數(shù)目分析、細(xì)胞清除、純化、轉(zhuǎn)輸、HSC與NKT細(xì)胞共培養(yǎng)、分離肝實質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)等方法。通過上述研究手段，我們?nèi)〉玫闹饕Y(jié)果是：
　　 1、HBV-tg鼠可以自發(fā)肝臟纖維化

4、通過檢測肝臟損傷（alanine aminotransferase，ALT，病理HE染色），我們發(fā)現(xiàn)六個月大的HBV-tg鼠肝損傷明顯比相同年齡的對照鼠C57BL/6嚴(yán)重。對肝臟切片的天狼猩紅（Sirius Red）染色和纖維化相關(guān)分子的熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)六個月大的HBV-tg鼠與C57BL/6鼠相比明顯自發(fā)肝臟纖維化。
　　 2、HBV-tg鼠對CCl4長期誘導(dǎo)的肝臟纖維化更加敏感每周兩次注射CCl4連續(xù)注射2周-14周

5、誘導(dǎo)C57BL/6鼠和HBV-tg鼠產(chǎn)生肝臟纖維化。發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝臟纖維化更加嚴(yán)重。我們首次發(fā)現(xiàn)，HBV-tg鼠可以作為很好的模擬人的乙肝攜帶者發(fā)展為肝臟纖維化的小鼠模型。
　　 3、HBV-tg鼠NKT細(xì)胞通過活化HSC促進(jìn)了肝臟纖維化研究發(fā)現(xiàn)，給Rag1-/-鼠轉(zhuǎn)輸來自HBV-tg鼠的淋巴細(xì)胞可以引起Rag1-/-鼠肝臟纖維化，而轉(zhuǎn)輸來自C57BL/6鼠的淋巴細(xì)胞則不可以。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在急性或慢性CCl4誘導(dǎo)下，

6、HBV-tg鼠的肝臟NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例和數(shù)目均比C57BL/6鼠多。通過細(xì)胞清除、轉(zhuǎn)輸?shù)葘嶒灠l(fā)現(xiàn)，HBV-tg鼠的肝臟NKT細(xì)胞對HSC活化具有促進(jìn)作用。同時NKT細(xì)胞也促進(jìn)了纖維化相關(guān)分子表達(dá)，從而加重了HBV-tg鼠的肝臟纖維化。
　　 4、NKT細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)HSC的活化 NKT細(xì)胞怎樣活化HSC？我們發(fā)現(xiàn)與C57BL/6鼠相比，HBV-tg鼠在CCl4刺激下肝臟NKT細(xì)胞總數(shù)增多，同時分泌細(xì)胞因子IFN-

7、γ，IL-4和IL-13的NKT細(xì)胞數(shù)目增多。將HBV-tg鼠通過流式分選出的肝臟NKT細(xì)胞，與通過肝臟灌流分離出來的HSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞可以活化HSC。如果在共培養(yǎng)體系中加入抗IL-4和IL-13的中和抗體，這種活化作用會消失；如果加入抗IFN-γ的中和抗體沒有這種作用。說明NKT細(xì)胞通過分泌Th2類細(xì)胞因子（eg，IL-4，IL-13）活化HSC。
　　 5、HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞可以自發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變（epith

8、elial-mesenchyma-transition，EMT) HBV-tg鼠中除了NKT細(xì)胞對肝臟纖維化具有促進(jìn)作用，我們發(fā)現(xiàn)其肝實質(zhì)細(xì)胞也發(fā)揮了促進(jìn)作用。來自六個月大的C57BL/6鼠和HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞通過肝臟灌流分離出來體外培養(yǎng)，可以明顯看出來自HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞比來自C57BL/6鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的間質(zhì)細(xì)胞表型。經(jīng)過定量PCR檢測EMT的標(biāo)志分子波形蛋白（vimentin），發(fā)現(xiàn)其在HBV-tg鼠的

9、肝實質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，更加證明HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞可以自發(fā)EMT。對兩種鼠分離得到的肝實質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行纖維化相關(guān)分子檢測，發(fā)現(xiàn)這些分子在六個月大的HBV-tg鼠中表達(dá)增高，表明HBV-tg鼠肝實質(zhì)細(xì)胞發(fā)生EMT對肝臟纖維化具有促進(jìn)作用。6、HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞在CCl4誘導(dǎo)纖維化過程中通過發(fā)生EMT促進(jìn)纖維化的發(fā)生對CCl4誘導(dǎo)肝臟纖維化的HBV-tg鼠和C57BL/6鼠原代分離肝實質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),在不同的時間點進(jìn)行拍照比較

10、，可以看出來自HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞具有更加典型的成纖維細(xì)胞表型，進(jìn)一步通過定量PCR檢測vimentin，HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞表達(dá)vimentin增加，說明HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)肝臟纖維化過程中更容易發(fā)生EMT。對纖維化相關(guān)分子檢測，也發(fā)現(xiàn)在某些時間點這些分子表達(dá)上調(diào)。這個結(jié)果說明在CCl4誘導(dǎo)肝臟纖維化過程中，肝實質(zhì)細(xì)胞也起到促進(jìn)作用。
　　 7、NK細(xì)胞具有抑制HBV-tg鼠EMT的作用我們發(fā)現(xiàn)對HBV

11、-tg鼠注射CCl4 24小時，肝臟EMT標(biāo)志分子vimentin表達(dá)會增高。通過細(xì)胞清除實驗發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對EMT具有一定的抑制作用。推測NK細(xì)胞可能通過作用在CCl4誘導(dǎo)下肝實質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的DR5發(fā)揮抑制作用。
　　 8、HBV-tg鼠發(fā)生EMT對乙肝誘發(fā)肝癌具有促進(jìn)作用我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細(xì)胞容易發(fā)生EMT。最新的研究顯示，EMT對癌癥發(fā)生具有促進(jìn)作用。同時我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠晚期會自發(fā)肝臟腫瘤；通過每周兩次C