FKBP51在小鼠肝臟纖維化中的作用以及分子機制的探究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 FKBP51在小鼠肝臟纖維化中的作用以及分子機制的探究
　　目的:肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。雖然肝纖維化發(fā)病率高，但目前對其發(fā)病機制尚不完全清楚，且無有效的根本的抗纖維化治療藥物。本論文第一部分通過創(chuàng)建FKBP51基因敲除小鼠肝臟纖維化模型，研究FKBP51在肝臟纖維化中的作用，以期尋找預(yù)防和治療肝臟纖維化的新的靶點。

2、r>　　方法:通過創(chuàng)建FKBP51基因敲除(KO)小鼠肝臟纖維化模型，分析FKBP51基因的缺失對肝臟的影響。1）FKBP51基因敲除小鼠的肝臟纖維化模型創(chuàng)建。將實驗小鼠分為四組，分別為注射橄欖油的野生型(WT)小鼠(WT-Con)、注射橄欖油的FKBP51基因敲除小鼠(KO-Con)、注射四氯化碳的野生型小鼠(WT-CC L4)、注射四氯化碳的FKBP51基因敲除小鼠(KO-CCL4)，腹腔注射，每周三次，持續(xù)兩周;2)肝臟表觀病理觀

3、察。對肝臟取材后觀察四組肝臟的色澤、質(zhì)地以及表面光滑度;3)肝臟病理學分析。對四組小鼠肝臟切片，分別進行HE染色，Masson染色，纖維化程度分析，來研究WT和KO小鼠肝臟組織病理學變化;4）利用Real-time實驗，對與肝臟纖維化相關(guān)的分子進行檢測;5）免疫組化實驗。對纖維化標志分子進一步進行驗證;6）測定細胞凋亡。對四組小鼠的肝臟切片進行細胞凋亡的檢測;7）免疫印跡實驗。對四組小鼠肝臟組織中的自噬、代謝、TGF-β通路相關(guān)基因進行

4、檢測。
　　結(jié)果:1）通過免疫組織化學方法鑒定證明成功構(gòu)建了WT和KO肝臟纖維化動物模型;2）通過對肝臟表觀進行觀察發(fā)現(xiàn):CCL4處理組中，WT小鼠肝臟色澤暗淡，質(zhì)地硬，表面粗糙，布滿小顆粒纖維化結(jié)節(jié)，而FKBP51KO小鼠肝臟色澤較淡，質(zhì)地較硬，表面較粗糙，布滿少量小顆粒纖維化結(jié)節(jié)，比野生型小鼠纖維化程度輕;3)肝臟病理學分析發(fā)現(xiàn):CCL4處理組中，WT小鼠肝細胞變性壞死，匯管區(qū)可見大量纖維組織增生且炎癥細胞多，而FKBP51K

5、O小鼠炎癥細胞少且膠原沉積少;4）通過Real-time和免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，CollagenⅠ、TIMP1、CTGF和α-SMA等纖維化標志蛋白在FKBP51基因敲除小鼠中的表達明顯少于野生型小鼠，且與肝臟纖維化Marker相關(guān)的細胞因子CTGF、IL6、INF-γ、TGF-β、TNF-α也出現(xiàn)此趨勢;5）通過對WT和KO小鼠肝臟進行凋亡測定實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP51基因敲除小鼠肝臟凋亡細胞很少，細胞中幾乎無胞核固縮、染色質(zhì)邊聚、胞核染成棕

6、黃色等凋亡現(xiàn)象，而野生型小鼠肝臟細胞出現(xiàn)大量凋亡細胞;6）免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn):FKBP51基因敲除小鼠自噬較WT相比明顯加強，而與纖維化相關(guān)的TGF-β中的通路分子在KO小鼠中明顯被抑制。
　　結(jié)論:FKBP51參與TGF-β通路介導的CCL4誘導的肝臟纖維化過程，F(xiàn)KBP51KO小鼠抵御CCL4誘導的肝臟纖維化。
　　第二部分 Fkbp51基因敲除小鼠肝臟與大腦海馬區(qū)RNA表達譜系的分析比較
　　目的:通過分析野生型小

7、鼠(WT)與Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝臟、海馬RNA表達譜系之間的差異，研究Fkbp51基因在代謝通路和神經(jīng)通路中的作用。
　　方法:利用第二代測序技術(shù)對Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬mRNA進行表達譜測序，將測序結(jié)果用BRB-ArrayTools進行分析，篩選出小鼠肝臟與海馬的差異基因，然后分別利用在線工具DAVID對差異基因進行GO本體分析，STRING數(shù)據(jù)庫對其進行蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Geneca

8、rd對基因進行注釋。
　　結(jié)果:(1)Fkbp51的缺失，在肝臟中造成類固醇生物合成及代謝、脂類物質(zhì)代謝以及氧化還原反應(yīng)等相關(guān)基因表達水平的變化;(2)在海馬中造成機械刺激探測、學習或記憶、突觸傳遞的調(diào)節(jié)、PPAR信號通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等相關(guān)基因表達水平的變化;(3)在肝臟與海馬中，F(xiàn)kbp51的缺失同時造成了11個基因的共差異表達，這11個基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖顯示:HMGCS2與INSIG1及相關(guān)蛋白形成網(wǎng)絡(luò)