甘草黃酮抗硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用以及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化（Hepatic Fibrosis，HF）是肝臟對(duì)各種損傷因子的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)(Extra Celluar matrix，ECM)過度沉積為病理特征，是各種慢性肝病共有的病理過程。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，肝纖維化是一個(gè)可逆轉(zhuǎn)的病理過程。然而，目前臨床上缺乏確切有效的抗肝纖維化藥物及治療方法。所以，尋找有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物是目前保肝藥物研究的熱點(diǎn)。而我國中草藥在抗肝纖維化療效方面具有良

2、好的藥理活性。
　　甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）入藥已有悠久歷史。早在二千多年前，《神農(nóng)本草經(jīng)》就將其列為藥之上乘。南朝醫(yī)學(xué)家陶弘景將甘草尊為“國老”，并言：“此草最為眾藥之王，經(jīng)方少有不用者”。“國老”，即帝師之稱。把甘草推崇為藥之“帝師”，其原因正如李時(shí)珍在《本草綱目》中所釋：“諸藥中甘草為君，治七十二種乳石毒，解一千二百草木毒，調(diào)和眾藥有功，故有‘國老’之號(hào)”?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，甘草性平，味甘

3、，歸十二經(jīng)，有解毒等諸多藥理作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草及其富含的活性成分具有保肝和抗肝纖維化的作用。
　　寧夏甘草的栽培技術(shù)已獲成功，種植面積達(dá)5萬余畝。在形成圍欄保護(hù)面積達(dá)40萬余畝的豐富資源優(yōu)勢(shì)同時(shí)，一方面，對(duì)寧夏人工栽培甘草在化學(xué)成份、質(zhì)量分析方面進(jìn)行了大量的研究工作；另一方面，結(jié)合產(chǎn)業(yè)化要求，制訂了相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和（總）黃酮成份的提取工藝標(biāo)準(zhǔn)。
　　本研究根據(jù)以甘草黃酮（Licorice Flavonoids，L

4、F）為研究對(duì)象，采用硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，明確甘草黃酮的抗肝纖維化作用，研究其保肝作用相關(guān)分子機(jī)制的同時(shí)，以期為甘草的開發(fā)、利用提供可靠的藥理學(xué)研究。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.復(fù)制硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化動(dòng)物模型，通過血液生化法、組織病理學(xué)方法，觀察肝功能相關(guān)生化指標(biāo)、肝纖維化相關(guān)病理指標(biāo)，研究甘草黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化的干預(yù)作用；
　　2.通過分子生物學(xué)方法

5、觀察甘草黃酮對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和半胱天冬酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)水平及TGF-β1的mRNA水平的影響，探討甘草黃酮抗肝纖維化的可能作用機(jī)理。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　將84只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為7組。模型組給予腹腔注射（ip）硫代乙酰胺（150mg/kg），每周2次，連續(xù)12周復(fù)制肝纖維化模型；陰性對(duì)照組給予正常的飼養(yǎng)，同法給予生理鹽水；陽性對(duì)照組給予硫代乙酰胺的同時(shí)，給予的水飛薊素(silym

6、arin;30mg/kg)，灌胃給藥進(jìn)行干預(yù)；甘草黃酮各組在給予硫代乙酰胺同時(shí)，給予不同劑量（50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）的甘草黃酮進(jìn)行干預(yù)。第12周末大鼠禁食不禁水12小時(shí)。稱重后，行45mg/kg戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)ip麻醉，心尖取血，分離血清。采用生化法檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、HA的含量，肝組織中HYP的含量；HE、Masson染色觀察肝纖

7、維化的形成以及免疫組織化學(xué)法測(cè)量TGF-β1和Caspase-3蛋白含量，qRT-PCR方法檢測(cè)TGF-β1的mRNA表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.肝功能及肝纖維化相關(guān)的生化指標(biāo)結(jié)果：
　　（1）硫代乙酰胺誘導(dǎo)的模型組與正常對(duì)照組相比，血清中AST、ALT、ALP、HA、以及肝組織中HYP的活性明顯升高。說明肝纖維化形成，肝功能受損，模型成功建立；
　?。?）甘草黃酮各組與水飛薊素干預(yù)組血清中AST、ALT、A

8、LP、HA及肝組織中HYP含量較模型組顯著降低（P<0.01），說明甘草黃酮及水飛薊素在本次實(shí)驗(yàn)條件下，具有對(duì)抗硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的形成、保護(hù)肝功能的作用。
　　2.HE染色結(jié)果：
　　（1）在大體觀察下，模型組大鼠肝臟體積增大，重量增加。表面不光滑，有大小不等的顆粒狀外觀，并出現(xiàn)周圍組織廣泛粘連。說明肝纖維化造模成功；
　?。?）鏡下HE染色觀察，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈周圍的肝細(xì)胞變性，周邊肝細(xì)胞脂肪

9、變，間質(zhì)細(xì)胞大量彌漫增生。說明纖維組織增生明顯，形成肝纖維化，造模成功；
　?。?）甘草黃酮各組及水飛薊素組與模型組比較，肝纖維化形成得到明顯抑制，顯示較好的干預(yù)效果。且甘草黃酮400mg/kg劑量組與水飛薊素組優(yōu)于其他各組。說明甘草黃酮具有對(duì)抗硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的形成、保護(hù)肝功能的作用。
　　3.Masson染色結(jié)果：
　?。?）模型組匯管區(qū)見大量膠原纖維產(chǎn)生，膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔形成，肝臟組織膠原纖維增生

10、程度與正常對(duì)照組比較明顯增多(P<0.01)；
　?。?）甘草黃酮400mg/kg組與模型組相比肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞變性壞死和纖維組織增生程度明顯減輕（P<0.05，P<0.01），甘草黃酮400mg/kg組療效要優(yōu)于其他各組。說明甘草黃酮具有對(duì)抗硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的形成、保護(hù)肝功能的作用；
　?。?）水飛薊素組膠原纖維的形成程度與模型組相比較顯著降低（P<0.05），且甘草黃酮的作用與水飛薊素的作用相當(dāng)（P

11、>0.05）。
　　4.對(duì)肝臟TGF-β1蛋白表達(dá)的影響：
　　（1）TGF-β1蛋白在正常肝組織中僅弱表達(dá)；
　?。?）模型組較正常組TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01)；
　　（3）甘草黃酮各組TGF-β1蛋白的表達(dá)較模型組明顯減少(P<0.01)，甘草黃酮400mg/kg劑量組作用最為明顯(P<0.01)；
　?。?）水飛薊素組大鼠肝臟TGF-β1蛋白表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.01)；甘草

12、黃酮組與水飛薊素組相比較沒有差別（P>0.05）。
　　5.對(duì)肝臟Caspase-3蛋白表達(dá)的影響：
　?。?）模型組Caspase-3蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.01)；
　?。?）甘草黃酮各組及水飛薊素組Caspase-3蛋白表達(dá)較模型組明顯減少(P<0.01)，甘草黃酮400 mg/kg劑量組作用最為明顯；甘草黃酮組與水飛薊素組比較沒差別（P>0.05）。
　　6.對(duì)TGF-β1的mRNA表達(dá)的

13、影響：
　　（1）模型組TGF-β1的mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組比較明顯升高(P<0.01)；
　?。?）甘草黃酮組TGF-β1的mRNA的表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.01)，甘草黃酮400 mg/kg劑量組作用最為明顯；
　?。?）水飛薊素組TGF-β1的mRNA的表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.01)。甘草黃酮組與水飛薊素組比較沒差別（P>0.05）
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1.甘草黃酮具有抗硫代乙酰胺誘導(dǎo)