硫代乙酰胺誘導(dǎo)豚鼠肝纖維化及膽囊病變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝纖維化(Liverfibrosis)指的是肝臟慢性損傷后，肝臟內(nèi)纖維組織異常增生，在組織損害持續(xù)或修復(fù)過程中形成肉芽組織，此后細(xì)胞成分減少而纖維組織增加，導(dǎo)致肝臟病理學(xué)上的一系列改變。我國(guó)是肝炎肝硬化高發(fā)區(qū)，晚期肝硬化患者大部分死于其并發(fā)癥，而膽囊病變是其中嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前臨床上常碰到一部分肝硬化病人合并膽囊病變，特別是晚期肝硬化合并有急性膽囊炎、慢性膽囊炎、膽囊結(jié)石等，在治療上往往存在許多矛盾，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)極大等難題。而肝纖維化作為肝

2、硬化發(fā)展的必經(jīng)階段的病理過程，其進(jìn)展至肝硬化過程中是否存在同步的膽囊功能病理組織學(xué)的改變。以及兩者在病理狀態(tài)下的相互關(guān)系、相互影響，尤其是膽囊病變有否促進(jìn)肝硬化的發(fā)展，膽囊切除術(shù)后肝功能變化、肝硬化的轉(zhuǎn)歸機(jī)制及學(xué)說并不明確，為了更好地防治肝硬化合并膽囊病變，有必有對(duì)其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸機(jī)理作一研究。因而建立肝纖維化、肝硬化合并膽囊病變動(dòng)物模型顯得很有必要。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)建立此類模型成熟穩(wěn)定的方法。 目的：1在體重監(jiān)測(cè)下觀察硫代乙酰

3、胺(TAA)誘導(dǎo)豚鼠肝纖維發(fā)展過程的穩(wěn)定性及可行性，觀察豚鼠對(duì)TAA毒性作用的耐受性及易感性。體重變化與肝纖維化成模是否存在關(guān)系，體重監(jiān)測(cè)在成模過程中的作用。為進(jìn)一步建立成模率高、病理變化穩(wěn)定的肝硬化合并膽囊病變模型提供簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)的監(jiān)測(cè)手段。 2分析豚鼠肝臟病理纖維化分級(jí)與血清纖維化指標(biāo)水平是否存在相關(guān)性，為豚鼠肝硬化模型建立提供適用的監(jiān)測(cè)手段及提供理論依據(jù)。 3初步觀察肝纖維化過程中膽囊出現(xiàn)的病理變化，為肝硬化合

4、并膽囊病變模型研究作前期探索。 材料和方法：1取體重在250-300g(約3-4周齡)健康雄性豚鼠50只，隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組10只；實(shí)驗(yàn)組40只(其中TAA作用模型六周組20只，作用模型九周組20只)。5只/籠分籠飼養(yǎng)。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組均予豚鼠基礎(chǔ)飼料，不限量供應(yīng)。對(duì)照組不限量供應(yīng)750mg/LVitC飲用水；實(shí)驗(yàn)組予含濃度為0.03％TAA+750mg/LVitC飲用水誘導(dǎo)并不限量供應(yīng)，配制后Ph值應(yīng)為6.7～7.2，保證TA

5、A的化學(xué)穩(wěn)定性。各組飲用水每?jī)商炫渲聘鼡Q。 2體重監(jiān)測(cè)：每周同一天同一時(shí)段測(cè)體重。 3血清、肝臟、膽囊取材保存3.1飼養(yǎng)第七周末、第十周末用同法處理模型六周組、模型九周組與對(duì)照組，利用乙醚吸入麻醉后體外心臟穿刺采血(3-5ml)，剖腹后肝臟下緣上翻，靠近膽總管結(jié)扎膽囊管，再游離切斷肝臟血管及與周圍組織器官韌帶，完整取出肝臟及膽囊，不結(jié)扎肝臟相關(guān)離斷血管放血處死。離體解剖分離肝臟、膽囊。肝組織取自肝右外側(cè)葉1.5×1.5×

6、0.3cm3大小固定在10％甲醛固定液中，用于常規(guī)伊紅-蘇木素(HE)染色，Masson三色染色、Gomori銀染色法。根據(jù)肝組織內(nèi)纖維組織增生狀況分為5級(jí)：(S0無(wú)纖維化；S1門管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局限竇周及小葉內(nèi)纖維化；S2門管區(qū)周圍纖維化，伴纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；S3纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化；S4早期肝硬化。)。統(tǒng)計(jì)各組各個(gè)體肝纖維化程度。 3.2膽囊常規(guī)HE染色，觀察膽囊病理改變及外觀情況。4血液標(biāo)本4000r

7、pm離心15min，取其血清600ul置于-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。采用放射免疫分析法測(cè)定各標(biāo)本透明質(zhì)酸(HA)、層粘蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(ⅣC)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)血清值。嚴(yán)格按各試劑盒使用說明書操作，由SN-697全自動(dòng)雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器測(cè)沉淀物放射性計(jì)數(shù)。5統(tǒng)計(jì)分析：所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。用SPSS11.0軟件進(jìn)行多組資料t檢驗(yàn)、相關(guān)分析、Fisher精確檢驗(yàn)法，P＜0.05即認(rèn)為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

8、 結(jié)果：1體重監(jiān)測(cè)1.1第一周體重：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組按正常生理變化規(guī)律體重逐漸上升，體重增加平穩(wěn)。 1.2第二周后(實(shí)驗(yàn)組予TAA一周后)：對(duì)照組體重按生理規(guī)律體重變化逐漸上升，體重增加平穩(wěn)，豚鼠毛發(fā)順暢光澤好、食欲正常、活動(dòng)正常。實(shí)驗(yàn)各組：體重明顯下降，幅度最大者超過80g，豚鼠毛發(fā)出現(xiàn)蓬松、食欲不振下降、活動(dòng)減少，尤以體重變化大者為甚。第三、四周后體重緩慢回升，以后呈小幅度升降，個(gè)別逐漸上升。豚鼠毛發(fā)色澤、食欲、活動(dòng)逐漸好

9、轉(zhuǎn)。 1.3對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組組間體重均數(shù)比較：第二周：模型六周組、模型九周組VS對(duì)照組，P＞0.05，各組間體重均數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第七周：模型六周組、模型九周組VS對(duì)照組，P＜0.05，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透鹘M比較差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型六周組VS模型九周組，P＞0.05，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)個(gè)體體重變化存在差異。 2HA、LN、ⅣC、PCⅢ血清值2.1對(duì)照組：HA(250.71±72.37μg

10、/L)、LN(35.39±10.01μg/L)、ⅣC(6.21±3.08μg/L)、PCⅢ(2.86±1.94μg/L)；模型六周組：HA(233.64±67.62μg/L)、LN(44.61±12.88μg/L)、ⅣC(8.52±2.40μg/L)、PCⅢ(87.49±32.95μg/L)；模型九周組：HA(85.59±35.99μg/L)、LN(40.90±8.44μg/L)、ⅣC13.40±1.93μg/L)、PCⅢH(158.6

11、8±41.73μg/L)。 2.2Ⅳ型膠原值、Ⅲ型前膠原值均數(shù)比較：對(duì)照組、模型六周組、模型九周組相繼遞增，各組間t檢驗(yàn)P＜0.05，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；透明質(zhì)酸值均數(shù)比較：對(duì)照組、模型六周組、模型九周組相繼下降，各組間t檢驗(yàn)P＜0.05，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；層粘蛋白值均數(shù)比較：對(duì)照組、模型六周組、模型九周組變化不大，各組間t檢驗(yàn)P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3肝臟組織病理改變與纖維化分級(jí)3.1大體觀察：對(duì)照

12、組肝臟質(zhì)地軟、紅潤(rùn)，實(shí)驗(yàn)組肝臟顏色不同程度變深，淺褐色，質(zhì)地稍韌。 3.2顯微鏡觀察：3.2.1對(duì)照組：肝細(xì)胞、肝細(xì)胞索、肝小葉結(jié)構(gòu)正常。在門管區(qū)和小葉中央靜脈有少量的膠原纖維。 3.2.2模型六周組：出現(xiàn)斑片狀肝細(xì)胞壞死區(qū)，壞死區(qū)有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，自門靜脈周圍向外蔓延，并有中央靜脈周圍少量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，肝細(xì)胞核稍增大；炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重；肝細(xì)胞壞死區(qū)見大量的淋巴細(xì)胞，伴有肝細(xì)胞脂肪樣變；膠原纖維間隔增生明顯，膠原纖

13、維從門管區(qū)處往外延伸到鄰近門管區(qū)及肝小葉內(nèi)。 3.2.3模型九周組：炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，門管區(qū)、中央靜脈大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，門管區(qū)間出現(xiàn)橋接壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，部分中央靜脈變窄、偏位、缺如，門管區(qū)內(nèi)纖維組織增生，出現(xiàn)粗大的纖維間隔，部分標(biāo)本可見形成假小葉。 3.2.4纖維化形成統(tǒng)計(jì)：S0：(對(duì)照組10例)S1：(模型六周組4例)S2：(模型六周組14例；模型九周組5例)S3：(模型六周組1例；模型九周組9例)S4：(模型

14、九周組2例) 4肝纖維化分級(jí)與肝纖維化血清指標(biāo)的相關(guān)性4.1Ⅳ型膠原值與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=0.572，p＜0.01，纖維化程度越高Ⅳ型膠原值越大。 4.2Ⅲ型前膠原值與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=0.910，p＜0.01，纖維化程度越高透明質(zhì)酸值越大。 4.3透明質(zhì)酸值與肝纖維化分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=-0.574，p＜0.01，纖維化程度越高透明質(zhì)酸值越小。 4.4層粘蛋白值與肝

15、纖維化分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)R=0.087，p＞0.05。5膽囊病理觀察 5.1大體觀察：對(duì)照組膽囊壁表面光滑，血管稀疏，無(wú)擴(kuò)張，膽汁較透明。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M膽囊壁表面有部分隆起，血管明顯增多，膽汁混濁。 5.2病理改變按慢性膽囊炎病理分級(jí)結(jié)果：(1)、模型六周組：輕度11例，中度例6例，無(wú)明顯改變2例。(2)、模型九周組：輕度3例，中度6例，重度7例。 結(jié)論：1本實(shí)驗(yàn)表明豚鼠對(duì)TAA藥物毒性反應(yīng)有很好的耐受性和易

16、感性，經(jīng)飲用水?dāng)z入TAA可以作為一種簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、適宜的方法應(yīng)用于豚鼠肝纖維化、肝硬化誘導(dǎo)過程。體重監(jiān)測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)、安全、有效的監(jiān)測(cè)手段。 2PC-Ⅲ、Ⅳ-C血清水平與豚鼠肝纖維化發(fā)展程度有很好的相關(guān)性，PC-Ⅲ、Ⅳ-C水平可作為豚鼠肝纖維化血清評(píng)價(jià)指標(biāo)。LN、HA血清水平與其他實(shí)驗(yàn)及臨床結(jié)論相悖，需進(jìn)一步研究。 3本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ碗嗍蟾卫w維化病理變化及膽囊病理變化結(jié)果，初步表明誘導(dǎo)豚鼠肝纖維化過程中膽囊已出現(xiàn)早期病變，其