新型結(jié)核病亞單位疫苗的評(píng)價(jià).pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis, Mtb）引起的，是一種長(zhǎng)期危害人類健康的疾病，同艾滋病、瘧疾并列為世界三大疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織于2013年公布的“GlobalTuberculosis Report2013”顯示2012年全球有860萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病病例，130多萬(wàn)結(jié)核病死亡病例。到目前為止，卡介苗(BCG)是唯一的被批準(zhǔn)的結(jié)核病預(yù)防用疫苗，對(duì)兒童的保護(hù)效果很好，

2、但是對(duì)成人的保護(hù)力是1％-80％不等，而且有人群和地區(qū)的差異。因此研發(fā)新型的高效的結(jié)核病防治疫苗是各國(guó)學(xué)者努力的重點(diǎn)。本研究中選用結(jié)核桿菌兩種重組蛋白Ag85B和EC為抗原成份，研究鋁佐劑和Poly(I∶C)佐劑對(duì)兩種抗原的免疫輔助效應(yīng)，并篩選出Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C)這一候選疫苗在豚鼠預(yù)防模型和潛伏感染模型上評(píng)價(jià)其保護(hù)效力和免疫治療作用。
　　一、新型結(jié)核病亞單位疫苗的免疫原性評(píng)價(jià)
　　免疫小鼠對(duì)預(yù)期疫苗

3、的免疫原性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。對(duì)BALB/c小鼠后肢內(nèi)側(cè)肌肉進(jìn)行注射，共注射3次，間隔10天，第3針后兩周摘眼球采血，分血清，用于ELISA檢測(cè)檢測(cè)Ag85B蛋白和EC蛋白特異性IgG水平，同時(shí)取脾分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)行抗原特異性的IFN-γ ELISPOT檢測(cè)。結(jié)果表明，Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C)組小鼠血清中抗原特異性IgG水平、分泌抗原特異性IFN-γ細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組，而且與單獨(dú)給予蛋白免疫組比較也是顯著增高。這表明Ag8

4、5B+EC+Al+Poly(I∶C)在小鼠體內(nèi)引起較高的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，可作為候選疫苗繼續(xù)進(jìn)行其他相關(guān)研究。
　　二、新型結(jié)核病亞單位疫苗預(yù)防結(jié)核感染的評(píng)價(jià)
　　在豚鼠預(yù)防模型上對(duì)候選疫苗(Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C))的抗結(jié)核保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要是觀察結(jié)核分支桿菌攻擊后豚鼠相關(guān)臟器的病變情況及脾臟荷菌數(shù)，并和BCG的保護(hù)效果相比較。疫苗組和陰性組均免疫3次，間隔10天，BCG組僅其它組第3次免疫時(shí)免

5、疫1針。末次免疫30天后攻毒500 CFU/ml的細(xì)菌懸液進(jìn)行攻毒，0.5 ml/只，感染途徑為皮下注射。攻毒41天后解剖動(dòng)物。豚鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行安樂(lè)死，取肝臟、脾臟和肺臟進(jìn)行病理檢查，計(jì)算病變?cè)u(píng)分;取脾臟，研磨后接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，四周后計(jì)數(shù)菌落數(shù)然后計(jì)算脾菌負(fù)荷量。結(jié)果表明，候選疫苗(Ag85B+EC+Al+Poly(I∶C))不能明顯減輕Mtb攻毒后豚鼠的臟器病變，也不能有效抑制Mtb在動(dòng)物體內(nèi)的增殖。這兩項(xiàng)指標(biāo)較生理

6、鹽水組僅略有降低，無(wú)顯著性差異，而B(niǎo)CG組的病變指數(shù)和脾荷菌數(shù)都降低明顯。說(shuō)明BCG有很好的結(jié)核感染預(yù)防作用，但是候選疫苗并沒(méi)有有效的保護(hù)效果，即這一疫苗不適合做預(yù)防用疫苗。
　　三、新型結(jié)核病亞單位疫苗對(duì)結(jié)核潛伏感染治療的評(píng)價(jià)
　　動(dòng)物感染Mtb成功后，給予異煙肼化學(xué)治療使動(dòng)物處于潛伏感染狀態(tài)，然后再用候選疫苗進(jìn)行治療，主要觀察豚鼠體重、相關(guān)臟器的病變情況及脾、肺荷菌數(shù)變化情況，以評(píng)價(jià)Poly(I∶C)佐劑在感染后治療中的

7、免疫刺激效應(yīng)。經(jīng)腹股溝皮下感染Mtb單細(xì)胞懸液，5000 CFU/0.5 ml/只。皮試確定感染成功后，用異煙肼灌胃治療，10 mg/0.5 ml/只，每周一、三、五給藥，共給藥4周。化學(xué)治療結(jié)束后分組，用疫苗治療，均為大腿肌肉給藥，治療6次，間隔時(shí)間為10天。末次治療后4周進(jìn)行解剖。解剖前對(duì)豚鼠體重進(jìn)行稱量，以觀察疫苗對(duì)體重是否有影響，然后對(duì)豚鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行安樂(lè)死，取肝臟、脾臟和肺臟進(jìn)行病理檢查，計(jì)算病變?cè)u(píng)分;取脾臟和肺，研