牛結核病DNA疫苗的研究.pdf

1、牛結核病是主要由牛分枝桿菌引起的一種慢性消耗性疾病,在許多國家尤其是發(fā)展中國家仍廣泛流行,該病不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,而且嚴重威脅著人類的身心健康.因此,控制牛結核病對防治人類結核病意義重大.然而,至今仍沒有一種疫苗可用于該病的預防. 本研究利用PCR技術和重疊延伸剪接技術(splice by overlapping extension,SOE),以牛分枝桿菌Vallee Ⅲ菌株的基因組為模板,擴增ag85b、esat-

2、6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65.esat-6、mpb64-esat-6融合基因,連接到真核表達載體pCDNA3.1(+)中,構建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Ag85B(簡稱pCA)、pCDNA3.1-ESAT-6(簡稱pCE6)、pCDNA3.I-HSP65(簡稱pcH)、pCDNA3.1-MPB64 (簡稱pCM) pCDNA3.1-Ag85B.ESAT-6 (簡稱pCAE)、pCDNA3.1-HS

3、P65.ESAT-6(簡稱pCHE)和pCDNA3.1-MPB64.ESAT-6(簡稱pCME).轉(zhuǎn)染SP2/0細胞,檢測目的基因的表達.以各重組質(zhì)粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB/c小鼠,免疫3次,每次間隔2周,1免后每周以牛分枝桿菌純化蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)為包被抗原,間接ELISA方法檢測血清抗體水平;以牛分枝桿菌PPD和刀豆蛋白A(ConcanavalinA,C

4、onA)為刺激原,MTT法檢測脾淋巴細胞增殖情況.3免2周后以ELISA試劑盒檢測脾細胞分泌IFN-γ,的情況.結果表明,除pCH組外,其他各重組質(zhì)粒免疫后小鼠血清抗體水平持續(xù)上升,與pCDNA3.1(+)對照組和PBS對照組相比差異顯著(p<0.05).3免2周后,融合DNA疫苗免疫組的刺激值(SI值)與單價DNA疫苗免疫組相比差異顯著(p<0.05).PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫組小鼠脾細胞分泌的IFN-γ高于單價DNA疫苗組

5、(p<0.05),而ConA刺激后各疫苗組分泌的IFN--γ水平均高于PPD刺激時(p<0.05),其中以pCAE和pCME組最高.以上結果表明在誘導細胞免疫應答方面融合DNA疫苗要優(yōu)于單價DNA疫苗. 同樣,利用PCR和SOE技術,獲得牛分枝桿菌mpb64-ag85b和mpb64-ag85b-esat-6融合基因,以pCDNA3.1(+)為載體構建了牛分枝桿菌多價組合和多基因融合DNA疫苗:二基因融合(pCDNA3.1-MPB

6、64-Ag85B,簡稱pcMA)和三基因融合(pCDNA3.1-MPB64-Ag85B-ESAT-6,簡稱pCMAE)DNA疫苗;二價組合(pCA+pCM)和三價組合(pCA+pCM+pCE6)DNA疫苗,免疫BALB/c小鼠,以牛分枝桿菌BCG免疫組為陽性對照,以pCDNA3.1(+)及PBS免疫組為陰性對照,共免疫3次,每次間隔2周,BCG組僅初免時皮下免疫1次.1免后每周,以原核表達純化的重組MPB64-Ag85B-ESAT-6蛋

7、白(rMAE)和牛分枝桿菌PPD為包被抗原,以間接ELISA方法檢測血清lgG水平及IgG亞類.每次免疫2周后以rMAE蛋白和PPD刺激,MTT法檢測脾淋巴細胞增殖情況,試劑盒檢測IFN-γ.,和IL.2的分泌情況.3免3周后以1×10<'6>CFU的BCG進行攻毒.攻毒3周后,以間接免疫熒光試驗、肺臟荷菌數(shù)和病理組織學變化評價攻毒后的免疫保護效果.試驗結果表明,融合DNA疫苗免疫后產(chǎn)生的血清抗體水平、淋巴細胞增值(SI值)水平、IFN

8、-γ和IL-2水平明顯高_丁多價DNA疫苗(p<0.05),以rMAE蛋白為包被抗原和刺激原時BCG免疫組的抗體水平、SI值和分泌的IFN-γ,IL-2的量明顯低于融合DNA疫苗組,而與多價DNA疫苗組相當,以牛分枝桿菌PPD為包被抗原和刺激原時BCG免疫組的體液和細胞免疫指標均明顯優(yōu)于各DNA疫苗組.從攻毒保護效果來看,融合DNA疫苗組的保護效果明顯優(yōu)于多價DNA疫苗,達到了BCG疫苗的免疫保護水平,表明本研究制備的融合DNA疫苗具有