惡黑細(xì)胞中的谷氨酸信號(hào)通路及其與細(xì)胞骨架蛋白分子的作用機(jī)制.pdf

1、目的： 研究惡黑細(xì)胞中的谷氨酸信號(hào)通路及其與細(xì)胞骨架蛋白分子的作用機(jī)制。 方法： 1.微管相關(guān)蛋白2a(Microtubule-associated protein 2a，MAP2a)、離子型谷氨酸受體中的甲基-D-天冬氨酸受體 2A(N-methyl-D-aspartate receptors 2A，NMDAR2A)、代謝型谷氨酸受體1(metabotropic glutamate receptor 1，mGl

2、uR1)在人類侵襲性惡黑細(xì)胞WM451LU細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布差異研究：培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞、WM451LU細(xì)胞；在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增重組腺病毒-微管相關(guān)蛋白2a(adenovims-mediated MAP2a,Ad-MAP2a)；對(duì)WM451LU細(xì)胞MAP2a基因轉(zhuǎn)染后進(jìn)行免疫熒光雙重染色及倒置熒光顯微鏡下觀察WM451LU細(xì)胞中MAP2a、NMDAR2A及mGluR1的細(xì)胞內(nèi)分布；進(jìn)一步在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察W

3、M451LU細(xì)胞中MAP2a與NMDAR2A及mGluR1的亞細(xì)胞分布。 2.上調(diào)MAP2a表達(dá)及神經(jīng)保護(hù)化學(xué)藥干預(yù)對(duì)WM451LU細(xì)胞形態(tài)的影響觀察：觀察轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a、NMDAR非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑MK-801以及選擇性的非競(jìng)爭(zhēng)性mGluR1拮抗劑CPCCOEt分別作用下，WM451LU細(xì)胞中α-微管蛋白(α-tubulin)的分布、密度以及細(xì)胞形態(tài)的變化。在原子力顯微鏡下觀察上調(diào)MAP2a表達(dá)、MK-801及CPCCOEt

4、分別及協(xié)同作用下WM451LU細(xì)胞樹突形態(tài)的影響。 3.轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a對(duì)WM451LU細(xì)胞內(nèi)NMDAR2A及mGluR1蛋白表達(dá)水平的影響：通過流式細(xì)胞儀及Western Blot方法測(cè)定轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a后WM451LU細(xì)胞內(nèi)NMDAR2A及mGluR1的表達(dá)。 4　觀察CPCCOEt及MK-801對(duì)WM451LU細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果： 1.研究發(fā)現(xiàn)在人類侵襲性惡黑細(xì)胞WM451LU細(xì)胞中有N

5、MDAR2A及mGluR1的表達(dá)。NMDAR2A及mGluR1與微管相關(guān)蛋白MAP2a在WM451LU細(xì)胞中具有相同的亞細(xì)胞定位：均分布于細(xì)胞漿內(nèi)，并且主要位于細(xì)胞樹突內(nèi)。 2.轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a后WM451LU細(xì)胞內(nèi)α-tubulin的密度明顯增加，細(xì)胞的樹突明顯增長(zhǎng)，并且α-tubulin主要位于增長(zhǎng)的細(xì)胞樹突內(nèi)。在谷氨酸受體拮抗劑MK-801及CPCCOEt作用下WM451LU細(xì)胞內(nèi)α-tubulin的密度明顯增大，細(xì)胞

6、的樹突纖細(xì)而狹長(zhǎng)，明顯不同于陰性對(duì)照組細(xì)胞短而粗的細(xì)胞樹突，且α-tubulin主要分布于纖細(xì)、狹長(zhǎng)的細(xì)胞樹突內(nèi)。 3.MK-801單獨(dú)以及與MAP2a協(xié)同作用下WM451LU細(xì)胞恢復(fù)樹突化，其中以二者協(xié)同作用下細(xì)胞形態(tài)的改變更為顯著，細(xì)胞樹突明顯延長(zhǎng)，出現(xiàn)大量二級(jí)、三級(jí)細(xì)胞樹突，呈現(xiàn)出與正常黑色素細(xì)胞所特有的細(xì)胞形態(tài)極其相似的細(xì)胞形態(tài)。 4　轉(zhuǎn)染Ad-MAP2a后NMDAR2A及mGluR1的表達(dá)量無明顯變化。

7、 5 MK-801及CPCCOEt對(duì)人類侵襲性惡黑細(xì)胞WM451LU細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用。 結(jié)論： 1.WM451LU細(xì)胞中有NMDAR2A及mGluR1的表達(dá)，且其亞細(xì)胞分布與MAP2a一致。 2.MK-801以及CPCCOEt具有誘導(dǎo)WM451LU細(xì)胞樹突形成的作用，并可使WM451LU細(xì)胞樹突內(nèi)的微管蛋白密度增加。 3.MK-801單獨(dú)以及與MAP2協(xié)同作用下可誘導(dǎo)WM451LU細(xì)胞樹突形成，使