細(xì)胞骨架蛋白與漢賽巴爾通體胞內(nèi)感染機(jī)制相關(guān)性研究.pdf

1、漢賽巴爾通體是一類革蘭氏染色陰性、營養(yǎng)條件需求苛刻的兼性胞內(nèi)寄生的需氧小桿菌，主要寄生在血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及吞噬細(xì)胞內(nèi)，紅細(xì)胞內(nèi)寄生是該病原重要感染特點(diǎn)。漢賽巴爾通體是巴爾通體屬中傳播及致病譜最廣泛的一種人畜共患病病原，以貓為天然宿主，通過貓?jiān)榛蝌缍Ｒг谪埲褐袀鞑?。貓的抓咬可將該病傳播給人類，致使感染人群患以局部皮膚損傷及淋巴結(jié)腫大為特征的貓抓病，免疫力低下的感染人群則會引起感染性心內(nèi)膜炎、桿菌樣血管瘤、視神經(jīng)炎、肝脾性紫癜等疾病，

2、對人類的健康帶來嚴(yán)重威脅。然而巴爾通體病在全世界范圍內(nèi)仍屬于被忽視疾病范疇，該病研究在我國尚處于起步階段，存在大量誤診漏診病例，因此在診斷技術(shù)、流行病學(xué)及致病機(jī)制方面亟待深入研究。目前關(guān)于宿主細(xì)胞與漢賽巴爾通體感染的互作分子篩選鑒定及其與感染機(jī)制相關(guān)性研究有待進(jìn)一步闡明。鑒于此，本論文主要從以下幾個方面對該病原進(jìn)行研究:
　　 一.CFDA-SE標(biāo)記示蹤漢賽巴爾通體胞內(nèi)感染研究
　　 本研究通過用CFDA-SE標(biāo)記漢賽巴

3、爾通體，示蹤漢賽巴爾通體在細(xì)胞內(nèi)的感染特征。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)CFDA-SE染色10min可使?jié)h賽巴爾通體有效標(biāo)記上綠色熒光，標(biāo)記的漢賽巴爾通體能正常感染紅細(xì)胞，在感染復(fù)數(shù)比(MOI)為1，10和100時感染率分別為4.86％、3.85％和8.47％。標(biāo)記的漢賽巴爾通體在感染HeLa細(xì)胞時，能清晰觀察到細(xì)菌在胞內(nèi)形成的菌團(tuán)結(jié)構(gòu)(invasome)和環(huán)核感染的單菌形態(tài)。標(biāo)記的巴爾通體與未標(biāo)記的巴爾通體在細(xì)胞感染力上沒有顯著差別，說明CFD

4、A-SE標(biāo)記巴爾通體示蹤感染具有較好的可行性。該方法操作簡便，避免了抗體標(biāo)記感染示蹤實(shí)驗(yàn)費(fèi)時費(fèi)力的缺點(diǎn)。同時該方法為實(shí)時監(jiān)測巴爾通體在體內(nèi)外感染提供了一種技術(shù)方法，為本論文后續(xù)致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 二.細(xì)胞骨架蛋白與漢賽巴爾通體胞內(nèi)感染機(jī)制相關(guān)性研究
　　 (1)漢賽巴爾通體與宿主細(xì)胞互作蛋白的篩選
　　 本研究通過生物素標(biāo)記漢賽巴爾通體外膜蛋白，利用生物素親和素結(jié)合的原理，通過Pull-Down檢測技

5、術(shù)，篩選能與漢賽巴爾通體相互作用的HeLa細(xì)胞膜蛋白，并通過串聯(lián)質(zhì)譜對篩選的蛋白條帶進(jìn)行分析。結(jié)果證實(shí)HeLa細(xì)胞中有多種膜蛋白與巴爾通體具有結(jié)合互作活性，分子量大小在44-KD與70-KD之間。切取蛋白條帶進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，利用BioworksBrowser3.3軟件在HUMAN.v3.87.fasta數(shù)據(jù)庫中檢索，鑒定結(jié)果證實(shí)互作蛋白主要為細(xì)胞骨架蛋白和橋粒相關(guān)蛋白。因此，本論文以篩選的細(xì)胞骨架中間纖維角蛋白及微絲F-actin肌動

6、蛋白為切入點(diǎn)，進(jìn)一步研究細(xì)胞骨架與漢賽巴爾通體胞內(nèi)感染的相關(guān)性。
　　 (2)漢賽巴爾通體感染與細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)及重排相關(guān)性研究
　　 本實(shí)驗(yàn)以篩選的目標(biāo)細(xì)胞骨架蛋白基因?yàn)榘谢?，通過實(shí)時熒光定量PCR和western blot方法，從mRNA水平和蛋白水平研究漢賽巴爾通體感染細(xì)胞后，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。同時運(yùn)用熒光顯微技術(shù)及整裝細(xì)胞電鏡技術(shù)，觀察漢賽巴爾通體感染細(xì)胞后細(xì)胞骨架的形態(tài)變化。結(jié)果證實(shí)漢賽巴爾通體的

7、入侵能夠上調(diào)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，并以細(xì)胞骨架中間纖維角蛋白KRT6的表達(dá)水平上調(diào)最為顯著。通過細(xì)胞熒光染色證實(shí)漢賽巴爾通體感染細(xì)胞后，細(xì)胞骨架微絲發(fā)生重排，形成致密結(jié)構(gòu)分布在感染細(xì)菌菌團(tuán)外周。而角蛋白中間纖維在漢賽巴爾通體感染后發(fā)生顯著解聚，中間纖維束結(jié)構(gòu)消失。推測角蛋白表達(dá)量上調(diào)是上皮細(xì)胞抗?jié)h賽巴爾通體感染的一種特異性應(yīng)答。
　　 (3)細(xì)胞骨架蛋白對巴爾通體感染率的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞骨架蛋白解聚劑和穩(wěn)

8、定劑處理細(xì)胞，同時用CFDA-SE標(biāo)記的漢賽巴爾通體感染細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)研究特定細(xì)胞骨架蛋白與漢賽巴爾通體感染細(xì)胞的相關(guān)性。結(jié)果證實(shí)中間纖維解聚劑(EGTA)處理細(xì)胞后，促使?jié)h賽巴爾通體對上皮細(xì)胞的入侵。F-actin肌動蛋白解聚劑(細(xì)胞松弛素，CB)處理導(dǎo)致細(xì)胞微絲解聚，抑制漢賽巴爾通體對細(xì)胞的感染，并隨著CB濃度的增加對漢賽巴爾通體的入侵抑制效果越明顯。細(xì)胞經(jīng)F-actin肌動蛋白固定劑(鬼筆環(huán)肽，PHAL)處理后，漢賽巴爾通體