轉(zhuǎn)染Chk1、Chk2基因人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦腫瘤放療抵抗機(jī)制信號(hào)通路途徑的研究.pdf

1、第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦腫瘤的探討性
　　 研究目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stemcells，HUCMSCs）有對(duì)腫瘤定向遷移作用可以作為理想的基因治療載體以及間充質(zhì)干細(xì)胞本身分泌一些細(xì)胞因子可以抑制腫瘤生長(zhǎng)的雙向治療途徑的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行在細(xì)胞生物學(xué)上和分子生物學(xué)上對(duì)腫瘤細(xì)胞促使腫瘤細(xì)胞凋亡的影響和作用機(jī)制研究。
　　 方法：利用人臍帶組織經(jīng)膠原酶

2、消化后提取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)鑒定表面標(biāo)志物，傳代培養(yǎng)，利用Transwell 小室試驗(yàn)，以BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞為正常對(duì)照，觀察間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移作用，間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)、明膠酶譜和反向明膠酶譜來(lái)觀察間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，
　　 結(jié)果：Transwell 小室可見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤遷移顯著，間充質(zhì)干細(xì)胞和U251 腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)可觀察到U251 腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間質(zhì)呈現(xiàn)空泡樣變

3、化，一個(gè)星期左右腫瘤細(xì)胞破碎、凋亡，而間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞分別用不同的熒光染料共培養(yǎng)后，亦可見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞相互遷移整合在細(xì)胞間質(zhì)，明膠酶譜和反向明膠酶譜可見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌類組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）抑制腫瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。
　　 結(jié)論：間充質(zhì)干細(xì)胞有向腫瘤定向遷移的作用，并且其可以分泌細(xì)胞因子作用于腫瘤細(xì)胞，促使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡；在作為基因治療來(lái)說(shuō)，是一個(gè)很理

4、想的基因載體，另一方面可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)于使用間充質(zhì)干細(xì)胞可以治療腫瘤的特性，結(jié)合基因治療腫瘤的治療途徑是一個(gè)很理想且一舉兩得的治療方式。
　　 第二部分構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2基因?qū)δX膠質(zhì)瘤放療抑制抵抗性的研究目的：構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2（checkpoint kinase 1/2）基因。為研究干擾CHK1/2基因的表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療抵抗性的抑制進(jìn)而增加放療的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

5、>　　 方法：根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)提供的Chk1 及Chk2基因核苷酸序列，各選擇設(shè)計(jì)一條適合轉(zhuǎn)錄短發(fā)夾RNA（Small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，與pLK0.1 質(zhì)粒載體鏈接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，選擇單克隆，提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoRI 及NcoI 酶切，瓊脂糖凝膠電泳，DNA序列鑒定。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 進(jìn)行傳代擴(kuò)增。將轉(zhuǎn)染的U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系經(jīng)紫外線照射后，用RT-PCR

6、和Western blot 方法分別在mRNA和蛋白水平上測(cè)定CHK1及CHK2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)EcoRI 及NcoI 酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，表明寡核苷酸成功插入到所計(jì)劃的位點(diǎn)，測(cè)序鑒定正確，轉(zhuǎn)染MSC組（對(duì)照）和U251組mRNA和蛋白水平表達(dá)幾乎一致，經(jīng)紫外線照射后Chk1、Chk2基因表達(dá)明顯減弱。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建干擾Chk1、Chk2的shRNA表達(dá)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞

7、可抑制Chk1、Chk2基因的表達(dá)，進(jìn)而為增加腫瘤放療敏感性的研究和臨床治療奠定了很好的理論基礎(chǔ)。
　　 第三部分干擾下調(diào)Chk1/Chk2基因的表達(dá)對(duì)慢病毒轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞信號(hào)通路增加放療敏感效應(yīng)
　　 研究目的：研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2（Checkpoint kinase 1/2）基因后使得無(wú)法傳達(dá)下調(diào)信號(hào)cdc25家族成員和其他底物無(wú)法磷酸化，損傷信號(hào)無(wú)法傳遞到下游，而使得細(xì)胞周期無(wú)法阻止，損傷修復(fù)等生物

8、學(xué)任務(wù)傳遞失效，損傷的DNA錯(cuò)配或者復(fù)制壓力增加而造成復(fù)制失敗或錯(cuò)配后導(dǎo)致蛋白質(zhì)無(wú)法發(fā)揮正常的生物學(xué)校應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 方法：將U251腫瘤細(xì)胞系通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染干擾CHK1/2基因的表達(dá)，使用紫外線和X-ray照射細(xì)胞，比較沒(méi)有經(jīng)過(guò)干擾的腫瘤細(xì)胞和干擾后的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)變化和生存時(shí)間，通過(guò)RT-PCR、Real-time PCR和Westrn blot檢驗(yàn)RNA和蛋白質(zhì)水平。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染干擾基因的腫瘤細(xì)

9、胞受到離子和非離子射線照射后相較于沒(méi)有經(jīng)過(guò)干擾基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞生存時(shí)間短，在RNA和蛋白質(zhì)水平可見(jiàn)所表達(dá)的差異。
　　 結(jié)論：CHK1/2是磷脂酰肌醇-3-激酶樣激酶家族(PIKKs,phosphatedyl-inositol-3-kinase-like protein kinases)成員，ATM、ATR的下游底物，在經(jīng)過(guò)離子輻射、紫外線輻射等引起DNA損傷時(shí)被激活，但慢病毒轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系干擾CHK1、CHK2基因