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文檔簡介
1、背景和目的:
鼻咽癌(NPC)是一種發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤。占頭頸部惡性腫瘤的78.08%,占上呼吸道癌腫的92.99%。我國是鼻咽癌發(fā)病率最高的國家,而廣東、廣西、海南等地都是高發(fā)區(qū),其發(fā)病率大約是25-50例每100,000人,高于西方國家25倍。由于其特殊的解剖位置,所以手術(shù)的方法受到局限,因此治療主要依賴于放射治療。然而,即使給予根治劑量,5年內(nèi)仍有約30%的患者出現(xiàn)局部腫瘤復發(fā),30%至60%的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移。<
2、br> 腫瘤干細胞(CSC/TSC)的概念于2001年被正式提出。腫瘤干細胞具有四個重要特征:1、自我更新的能力。自我更新能力是腫瘤干細胞保持分化為前體細胞的能力。2、多分化潛能。多分化潛能使腫瘤干細胞能夠產(chǎn)生不同分化程度的子代腫瘤細胞,在體內(nèi)形成新的腫瘤。同一腫瘤組織中,分化成熟的腫瘤細胞惡性程度較低,而分化差的腫瘤細胞惡性程度高。3、高增值能力。大量實驗表明,CSC/TSC比普通腫瘤細胞具有更高的增值能力。4、耐藥性。多藥耐藥
3、是導致腫瘤治療失敗的主要原因之一。腫瘤干細胞細胞膜上多數(shù)表達ABC轉(zhuǎn)運體家族膜蛋白,能夠運輸并排出代謝產(chǎn)物,藥物等物質(zhì),使得許多對腫瘤非干細胞具有抑制或殺傷作用的化療藥物在腫瘤干細胞上發(fā)揮不了殺傷作用,或作用明顯減弱。目前,使用干細胞表面標記ALDH1+、CD44、CD133等,可以識別乳腺、腦、肺、肝癌的干細胞。最近的一項研究表明,干細胞可以通過優(yōu)先激活CHK1和CHK2的細胞周期檢驗點,增加DNA修復能力從而引起輻射耐受。
4、 c-MYC基因是MYC基因家族的重要成員之一,是一種可使細胞無限增殖,獲永生化功能,促進細胞分裂的基因,因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關。c-MYC基因的表達一般與細胞的生長狀態(tài)有關,然而在細胞分化時c-MYC表達則降低,發(fā)現(xiàn)c-MYC在細胞G0期到S期的過程中也起作用。表明c-MYC表達的變化與細胞的增殖及分化狀態(tài)有關,其表達產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細胞生長、分化或惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。MYC可以通過抑制p27激活cyclin E/Cdk2使成纖維細胞
5、靜止。以往的研究還表明, MYC可以同時激活p53和pten引起正常的和惡性干/祖細胞的分化,自我更新,及致瘤性。
本研究的目的是,根據(jù)PKH26熒光染料的特性,識別具有慢周期特性的PKH26+細胞,通過明確c-MYC對CHK1/2.的直接調(diào)節(jié)作用,闡述PKH26+細胞具有輻射抗性的機制,旨在揭示c-MYC介導的DNA損傷修復在鼻咽癌放療抵抗中的作用。
方法:
1.細胞和培養(yǎng)條件本實驗所用細胞均
6、由本實驗室保存。人鼻咽癌細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分選后的PKH26+以及PKH26-細胞使用的是無血清的未分化培養(yǎng)基(MEBM; Clonetics division ofCambrex BioScience)進行維持培養(yǎng)。
2.腫瘤球培養(yǎng):
將分選鼻咽癌細胞及經(jīng)過不同方式處理后的細胞,置于低粘附
7、培養(yǎng)板中,用含DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng),含2% N2,2% B27,20 ng/mL HGF,100ng/mLEGF,and1%真菌抗生素,懸浮于培養(yǎng),觀察細胞形成腫瘤干細胞球的過程。
3.免疫熒光
將待檢測樣品放入放有蓋玻片的6孔板中,4%多聚甲醛固定,PBS清洗,0.5%Triton X-100破膜,PBS清洗,加入一抗37℃孵育45min,PBS清洗,洗滌后加入熒光二抗,37℃孵育45min,PBS清
8、洗,DAPI染細胞核,在共聚焦顯微鏡下觀察。
4.細胞周期分析用胰蛋白酶消化細胞,用PBS洗滌,在懸浮在70%乙醇中,-20℃并儲存過夜。隨后離心,在PBS中洗滌,再懸浮在450ml的PBS和10ml,10mg/ml無DNase的RNase中,在37℃孵育45分鐘。RNase處理后,溶液中加入50μl的PI,細胞在室溫下孵育10分鐘,避光。分析之前,通過過濾除去細胞團塊,使用BDFACSDiva,對細胞周期進行了分析。
9、r> 5.側(cè)群細胞檢測將貼壁細胞或處理后的腫瘤細胞分離成單個細胞,離心后用PBS清洗,含2%胎牛血清的1640培基重懸,用Hoechst33342標記,標記的細胞在37℃孵育90min, PBS洗滌,重懸,檢測前加入Propidium Iodide標記死細胞,采用流式細胞儀檢測側(cè)群比例。
6.免疫印跡檢測蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上進行分析,將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,PVDF膜浸泡在封閉液中25℃2h,一抗4℃
10、孵育過夜,PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h,采用化學發(fā)光法檢測。
使用以下抗體:鼠抗人cyclin D1,cyclin A, and cyclin B(1∶300),鼠抗人ABCG2, CD-44, CHK1,CHK2,pCHK1, pCHK2 GAPDH(1∶1,000),和γ-H2AX(1∶1,000)。
7.克隆形成生存分析將剛分選的PKH26+和PKH26細胞進行計數(shù),并接種于6孔培養(yǎng)板。在室溫下,使
11、用直線加速器(2100EX,瓦里安)進行照射,劑量率300cGy的/分鐘,并培養(yǎng)14天。接著,將存活的克隆數(shù)目(定義為具有≥50個細胞的菌落)進行計數(shù)。
8.免疫組織化學石蠟切片經(jīng)脫蠟,乙醇梯度水化,抗原修復,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,一抗4℃孵育過夜,二抗25℃孵育10min,DAB顯色,顯微鏡觀察顯色,蘇木素復染核,鹽酸乙醇分化,脫水,透明。
9.實時定量(定量RT-PCR)表達CHK1,CHK2,c-MYC
12、使用的Taq-Man(@) MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaqMan通用PCR擴增預混試劑,根據(jù)由制造商提供的說明,使用二步法進行實時定量RT-PCR測定,GAPDH作為內(nèi)參歸一化。
10.熒光素酶檢測pGL4-hRluc/TK載體購自Promega公司。選定CHK1和CHK2的啟動子基因進行PCR擴增,并克隆到pGL4載體中。根據(jù)制造商提供的說明書,使用雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega),檢測熒光素和Renilla
13、熒光素酶的活性。在CHK1和CHK2啟動子區(qū)域,突變c-MYC基因與其結(jié)合位點,使用QuikChange多定點突變試劑盒(Stratagene公司)根據(jù)制造商提供的使用說明書對相應位點進行突變。
11.c-MYC綁定位點預測和ChIP實驗c-MYC在CHK1,CHK2啟動子區(qū)域的綁定位點的預測使用的是Patch軟件(http://www.biobase-international.com/gene-regulation)。
14、來自CNE2細胞的DNA的準備和細胞的裂解使用的是EZ-Zyme Chromatin Prep試劑盒(Millipore)。裂解后的樣品是用EZ-Magna ChIP試劑盒(Millipore)。所有的步驟均按照說明書進行操作。用來做CHIP的抗c-MYC抗體來自Santa Cruz Biotechnology,Inc。在CHIP分析準備完成以后,DNA樣品的擴增使用的引物見正文。
12.體內(nèi)成瘤實驗接種時細胞用100μl
15、按1∶1 RPMI-1640和Matrigel懸浮,觀察其成瘤情況如下,記錄小鼠腫瘤發(fā)生的時間;根據(jù)公式V=1/ab2(a為長徑,b為短徑)計算腫瘤體積,繪制腫瘤成長曲線,腫瘤生長數(shù)周后處死動物取出腫瘤組織。
13.統(tǒng)計方法采用統(tǒng)計軟件Graphpad5.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學處理和分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示。兩組腫瘤體積比較采用兩獨立樣本T檢驗;腫瘤球形成,PKH26陽性細胞和側(cè)群比例,細胞周期,動物成瘤
16、時間數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異,如方差齊性,多重比較采用LSD法;如方差不齊,采用Welch值,多重比較采用Dunnett T3法;在體腫瘤生長曲線的比較采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)比較各組間差異。P<0.05被認為有統(tǒng)計學差異。
結(jié)果:
1.鼻咽癌中PKH26+細胞的生物學特性在不同時間段用流式細胞儀檢測PKH26+細胞的比例,在第四周CNE1為2
17、.2%,CNE2為2.8%,分選這個比例的PKH26+的細胞進行下面的實驗,檢測PKH26+細胞的細胞周期,發(fā)現(xiàn)主要處于G1期(DNA合成前期),細胞周期蛋白cyclinD1,A在PKH26+的細胞中也高表達。分別檢測CNE1和CNE2細胞中的側(cè)群比例,可以看到PKH26+的細胞中比例明顯高于PKH26-的細胞。WeaernBlot檢測干細胞表面標記ABCG2和CD44也證實了這一點。經(jīng)過照射后PKH26+的細胞腫瘤球數(shù)目明顯多于PHK
18、26-的細胞;克隆形成實驗評價照射后PKH26+和PKH26-細胞的存活率,經(jīng)過8Gy的照射PKH26+的細胞克隆和照射前無明顯差別,而PKH26-的細胞8Gy基本上都殺死了。
2.PKH26+細胞引起的輻射抗性主要是通過c-MYC過表達。
給予PKH26+和PKH26-細胞8Gy的劑量,Western Blot檢測pCHK1、pCHK2、CHK1、CHK2個基因,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過照射PKH26+和PKH26-細胞中
19、CHK1和CHK2磷酸化水平均提高,但是,PKH26+細胞的磷酸化活化水平明顯高于PKH26-的細胞,表明PKH26+細胞表現(xiàn)出更大DNA損傷激活反應。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),細胞照射后PKH26+細胞c-MYC,pChk1,pChk2表達的增加,而且這三個基因均定位于細胞核中PKH26+細胞。為了闡明c-MYC和DNA損傷反應之間的關系,我們在鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2中構(gòu)建了c-MYC的過表達載體。我們發(fā)現(xiàn),DNA損傷相關蛋白γ-H2
20、AX的水平大大降低。在彗星實驗,顯示CNE1和CNE2細胞中過度表達c-My基因,DNA損傷細胞的比例明顯下降了。生物信息學的方法檢測了CHK1和CHK2基因上游約2000bp,分別發(fā)現(xiàn)了三個潛在的c-MYC基因的結(jié)合位點。在CNE2中進行(CHIP)分析c-MYC的所有假定位點。研究結(jié)果表明,c-MYC是最顯著綁定的位點是CHK1和CHK2的C和E位點。敲除c-MYC的可以減弱c-MYC與CHK1和CHK2的C和E位點的結(jié)合。熒光素酶
21、報告基因檢測發(fā)現(xiàn)c-MYC基因過表達,也可以使CHK1和CHK2的熒光素酶表達增加,突變C和E位點結(jié)果表明,突變后c-MYC基因的過度表達沒有使CE位點熒光素酶的活性增加。
3.c-MYC過表達增強PHK26+細胞的DNA修復能力和干性先在鼻咽癌細胞中沉默c-MYC基因,檢測照射后c-MYC表達和DNA損傷反應,緊接著,在PKH26+細胞中抑制c-MYC側(cè)群細胞比例減少,CNE1的PKH26+細胞側(cè)群比例從32.8%降至2
22、.4%,CNE2的PKH26+細胞側(cè)群比例從35.67%降至2.0%。為了進一步證實我們的假設,我們收集CNE1和CNE2細胞株的PKH26+細胞進行腫瘤球形成實驗,發(fā)現(xiàn)抑制c-MYC可以減少的腫瘤球數(shù)目。堿性彗星試驗中,我們用shc-MYC處理PKH26+細胞與對照組相比,損傷明顯增加。
4.c-MYC基因通過調(diào)節(jié)Chk1/2介導PK-H26+細胞的DNA損傷反應和抗輻射在CNE1和CNE2中抑制CHK1/2,用WB檢測
23、抑制效率。然后用彗星實驗證實慢病毒載體sh-Chk1/2干擾Chk1/Chk2的表達能使PKH2+細胞DNA損傷修復能力減弱。緊接著,對PKH26+細胞進行了為了c-MYC和CHK1/2的共感染,通過克隆形成實驗、Western Blot檢測,發(fā)現(xiàn)PKH26+細胞耐放療。此外,c-MYC基因的抑制可以引起PKH26+細胞對放射敏感,c-MYC基因介導的DNA修復取決于CHK1/2的活化。把分選的PKH26+細胞對裸鼠進行皮下注射。結(jié)合腫
24、瘤的體積和重量,我們發(fā)現(xiàn)給予不同的射線治療方式或Si-C-MYC并被沒有顯著的抑制腫瘤生長,si-c-MYC與放療進行聯(lián)合則可以明顯抑制腫瘤生長。WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)與未處理的腫瘤相比,用IR和si-c-MYC處理的腫瘤c-MYC,CHK1/2,和pCHK1/2表達水平降低。我們用免疫組織化法在62例原發(fā)的鼻咽癌標本檢測這些基因的表達水平,發(fā)現(xiàn)c-MYC基因的高表達與CHK1/2和CD44的表達水平呈正相關。
結(jié)
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