鼻咽癌放射抗拒細胞株CNE1-70R的建立及放射抗拒機制的初步探討.pdf

1、背景:
　　鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方地區(qū)常見的一種頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病率占世界80％左右。鼻咽癌在臨床上的病理分型主要為低分化鱗癌，對射線敏感，手術(shù)治療難以根治。放療是目前鼻咽癌的首要治療手段，但是容易發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移，治療失敗的主要原因是鼻咽癌組織中存在一定比例的放射抗拒細胞細胞。因此研究放射抗拒機制，尋找放射增敏途徑成為亟待解決的問題。由于腫瘤細胞存在異質(zhì)性，即使組織學上分化相

2、同的鱗狀細胞癌也會表現(xiàn)出不同的放射敏感性。顯然，如果以同一來源但具有不同放射敏感性的一對細胞為對象進行放射敏感性相關(guān)因素對照研究，將有更多的優(yōu)勢。
　　目的:
　　體外實驗模擬鼻咽癌臨床常規(guī)分割放療，建立經(jīng)大劑量射線照射后放射抗拒細胞模型CNE1/70R。研究兩株細胞放射敏感性，藥物敏感性，及經(jīng)射線照射后凋亡，細胞周期變化的差異。用裸鼠成瘤實驗體內(nèi)驗證放射抗拒株細胞CNE1/70R與放射敏感株細胞CNE1在生長速度方面差異。

3、初步探討兩株細胞周期相關(guān)蛋白CUEDC2的表達與放射抗拒之間的關(guān)系。通過應(yīng)用含人類全基因組序列芯片對兩個放射敏感性不同的鼻咽癌細胞株進行檢測，比較其基因表達譜的變化，尋找與鼻咽癌放射敏感性密切相關(guān)的基因。
　　方法:
　　將復蘇的人鼻咽癌細胞系CNE1進行培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。用臨床常規(guī)分割根治劑量70Gy（6Mv X線，70Gy/35天，2Gy/天，1次/日，5次/周）體外照射，建立鼻咽癌細胞模型CNE1

4、/70R。生長曲線檢測細胞倍增時間。MTT法檢測不同濃度多西紫杉醇(100、10、1、0.1、0.01μmol/L)、順鉑（1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/ml）對兩株細胞的生長抑制作用。細胞照射0，1，2，3，4，6，8Gy后，利用克隆形成實驗，擬合細胞存活曲線，比較放射敏感性。流式細胞術(shù)AnnexinⅤ/PI染色法檢測細胞經(jīng)0、4、8、12Gy照射后細胞凋亡發(fā)生率的變化，流式細胞PI染色檢測兩株細胞經(jīng)8Gy照射周

5、期的改變?；蛐酒夹g(shù)檢測兩株細胞的差異表達的基因。裸鼠實驗體內(nèi)驗證兩株細胞生長速度。Western Blot檢測兩株細胞CUEDC2蛋白的表達，qRT-PCR檢測兩株細胞CUEDC2基因的表達。
　　結(jié)果:
　　(1) CNE1/70R細胞群體倍增時間長于親代細胞。CNE1、CNE1/70R倍增時間分別為（1.483±0.046）d，(1.586±0.069)d。(2)細胞株CNE1/70R形成集落能力強于CNE1細胞，放

6、射生物學相關(guān)指標均提示CNE1/70R較CNE1具有放療抵抗，并且具有統(tǒng)計學差異p＜0.05。(3)放射抗拒細胞CNE1/70R與敏感株相比對藥物敏感性升高，多西紫杉醇和順鉑對CNE1和CNE1/70R細胞有明顯的抑制作用，IC50分別為0.049μmol/L vs0.001μmol/L。1.008μg/mL vs0.337μg/mL，CNE1/70R對多西紫杉醇利順鉑的敏感性增加。(4)細胞周期的結(jié)果顯示，細胞經(jīng)8Gy射線照射24小時

7、后，G0/G1期，S期細胞數(shù)減少，G2/M期細胞數(shù)增多，CNE1、CNE1/70R均出現(xiàn)G2/M期阻滯，CNE1細胞G2/M期阻滯更明顯。CNE1與CNE1/70R周期改變差異(p＜0.05)具有統(tǒng)計學意義。(5)細胞照射0Gy，4Gy，8Gy，12Gy后，兩細胞凋亡率均隨劑量增加而增加，CNE1細胞早期、晚期凋亡率均高于CNE1/70R細胞，兩細胞凋亡率比較差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。(6)人鼻咽癌放射抗拒株細胞移植瘤生長速度

8、較人鼻咽癌放射敏感細胞移植瘤慢。(7)兩組鼻咽癌細胞株基因都有差異的共有1191條，1172條表達上調(diào)，19條表達下調(diào)。功能涉及不同的分子功能分類，參與多個生物學過程。(8) qRT-PCR結(jié)果顯示放射抗拒株細胞CNE1/70R的CUEDC2基因相對表達較CNE1細胞有所上調(diào)。Western Blot結(jié)果顯示CNE1/70R的CUEDC2蛋白表達量較CNE1表達升高。
　　結(jié)論:
　　(1)采用臨床常規(guī)分割放療方法單次2Gy

9、照射35次模式可建立穩(wěn)定的人鼻咽癌放射抗拒株CNE1/70R。
　　(2)生長速度:細胞生長曲線實驗、裸鼠成瘤實驗均顯示鼻咽癌放射抗拒株細胞CNE1/70R生長速度較鼻咽癌放射敏感株細胞CNE1慢。
　　(3)藥物敏感性:鼻咽癌抗拒株細胞CNE1/70R細胞對化療藥物多西紫杉醇、順鉑更加敏感。臨床上為復發(fā)鼻咽癌患者治療提供新的理論基礎(chǔ)。
　　(4) CNE1/70R細胞株較親本細胞具有更突出的放射抗拒性，周期改變減小及