X線誘導(dǎo)鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株的建立及機(jī)制初探.pdf

1、目的： 目前研究鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)的輻射抗拒多用不同細(xì)胞或組織作為模型，這無(wú)法避免遺傳背景差異和腫瘤組織異質(zhì)性等對(duì)結(jié)果的影響。同時(shí)，有關(guān)NPC輻射抗拒機(jī)制至今仍未完全闡明。已有研究證實(shí)多個(gè)基因及蛋白與NPC的放射敏感性相關(guān)，但各作者就某選定指標(biāo)研究其與輻射抗拒的相關(guān)性，所得結(jié)果相對(duì)局限和片面。目前尚未見(jiàn)到采用高通量篩選方法，從cDNA和蛋白水平全方位審視同遺傳背景輻射抗拒機(jī)制全貌的

2、相關(guān)報(bào)道。因此，非常必要建立同起源和遺傳背景而不同輻射敏感性的細(xì)胞對(duì)比模型(CNE2R與CNE2)，從cDNA和蛋白水平篩查CNE2R與CNE2的差異，這對(duì)于揭示NPC輻射抗拒發(fā)生的本質(zhì)，挖掘評(píng)價(jià)輻射抗拒的靈敏指標(biāo)，并尋找和確立輻射抗拒的新靶點(diǎn)，從而找到有效預(yù)防和逆轉(zhuǎn)NPC輻射抗拒新療法的目的，具有至關(guān)重要的意義。 方法： 1.爬坡式大劑量X線誘導(dǎo)輻射耐受NPC細(xì)胞株CNE2R初次劑量為200 Gy，照射3次，后依次40

3、0 Gy，600 Gy各照射3次，每次照射后5～8周待存活的后代細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行下一次照射，整個(gè)照射及培養(yǎng)過(guò)程歷時(shí)11個(gè)月。 2.MTT法、平板克隆形成法及血清饑餓細(xì)胞周期同步化方法描繪細(xì)胞株CNE2R和CNE2的生長(zhǎng)曲線，分別計(jì)算兩者的倍增時(shí)間，測(cè)定不同照射劑量下的存活分?jǐn)?shù)，線性二次模型擬合劑量存活曲線并求出放射生物學(xué)參數(shù)α、β和2Gy存活分?jǐn)?shù)(SF2)。 3.染色體核型分析和STR分型分析染色體核型分析探討細(xì)胞株

4、CNE2R與CNE2染色體的差異，STR分型探討CNE2R與CNE2兩者之間染色體非編碼區(qū)STR基因座的差異。 4.基因芯片技術(shù)和熒光差異雙向電泳技術(shù)(2D—DIGE)及液質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC—MS/MS)分別從基因水平和蛋白質(zhì)水平探討細(xì)胞株CNE2R與CNE2差異表達(dá)的機(jī)制。 結(jié)果： 1.建立了輻射耐受NPC細(xì)胞株CNE2R MTT結(jié)果表明：CNE2R的生長(zhǎng)速度較原細(xì)胞株CNE2慢，CNE2R的倍增時(shí)間為4.0天

5、，CNE2的倍增時(shí)間是3.6天。CNE2R與CNE2的劑量存活曲線表明：CNE2R的曲線較CNE2的曲線平坦。CNE2R與CNE2線性二次模型參數(shù)分別為α(1.076vsO．974)，β(-0.302vs-0.319)，SF2(0.5861 vs0.3964)。 2.細(xì)胞株CNE2R與CNE2遺傳學(xué)的差異染色體核型分析結(jié)果表明：CNE2R與CNE2細(xì)胞間的染色體變異程度較大，而同一細(xì)胞株的不同細(xì)胞之間染色體變異程度相近。STR分

6、型結(jié)果顯示：STR基因座D8S1179的表達(dá)在CNE2R和CNE2細(xì)胞之間有質(zhì)的差異，D13S317和TH01的表達(dá)在CNE2R與CNE2之間有量的差異； 3.細(xì)胞株CNE2R與CNE2輻射抗拒差異機(jī)制的探討基因芯片結(jié)果顯示：CNE2R與CNE2相比較，兩個(gè)細(xì)胞株中表達(dá)差異的基因共有855個(gè)，其中表達(dá)變化上調(diào)的基因有538個(gè)，表達(dá)變化下調(diào)的基因有317個(gè)，差異表達(dá)的基因涉及凋亡、結(jié)合、代謝、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、結(jié)構(gòu)及

7、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程；并初步發(fā)現(xiàn)兩者之間輻射耐受的差異可能發(fā)生在8號(hào)和(或)13號(hào)染色體上。2D～DIGE結(jié)果表明：CNE2R與CNE2細(xì)胞相比，按照Student t test，P<0.05，Av Ratio≥1.00或者Av Ratio≤-1.00的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)濾，存在差異的點(diǎn)有16個(gè)。進(jìn)一步LC—MS/MS分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些點(diǎn)分別代表不同的鑒定蛋白群，其中蛋白14—3—3zeta和CASP1與腫瘤治療的輻射抗拒有關(guān)。 結(jié)論