siRNA干擾人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株eIF4E基因的研究.pdf

1、[目的]
　　 真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E),是蛋白質(zhì)合成起始階段的重要調(diào)控因子。該起始因子在多種頭頸部腫瘤細(xì)胞和組織中不僅高表達(dá),而且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。同時(shí),eIF4E的過(guò)表達(dá)狀態(tài)還可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及其放療耐受密切相關(guān)。本研究擬探討化學(xué)合成siRNA對(duì)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株eIF4E基因表達(dá)的抑制作用以及對(duì)靶細(xì)胞體外增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響。從而為eIF4E基因成為鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)性研究

2、基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 (1)利用免疫細(xì)化方法檢測(cè)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞中eIF4E蛋白表達(dá)情況。
　　 (2)通過(guò)脂質(zhì)體法將FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。
　　 (3)將5對(duì)靶向eIF4E基因的siRNA轉(zhuǎn)染人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立NC陰性對(duì)照組、Mock組(轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組)、空白對(duì)照組(Blank組)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過(guò)Real Time PCR和W

3、estern blot檢測(cè)eIF4E mRNA和蛋白的表達(dá)情況,篩選出抑制效率最高的siRNA。
　　 (4)以干擾效率最高的siRNA轉(zhuǎn)染人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞,通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h eIF4E蛋白表達(dá)水平的變化,采用CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別檢測(cè)eIF4E基因?qū)θ吮茄拾〤NE-2Z細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)eIF4lE蛋

4、白在人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞中高表達(dá)。
　　 (2)轉(zhuǎn)染后6h的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察顯示轉(zhuǎn)染效率約80％,已達(dá)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。
　　 (3)轉(zhuǎn)染后48h,Real Time PCR與Western blot結(jié)果均表明siRNA-5組抑制效率最高,分別為78.0%和82.0%,差異有顯著意義(P＜0.01)。
　　 (4)轉(zhuǎn)染siRNA-524h、48h、72h后,eIF4E蛋白表達(dá)抑制率分別為29.7%、78.

5、0%、97.0%,較陰性對(duì)照組明顯降低,差異有顯著意義(P＜0.01)。
　　 (5)轉(zhuǎn)染siRNA-5后24h、48h、72h,細(xì)胞增殖抑制率分別為4.17%、26.19%、17.92%,其中48h、72h抑制率較陰性對(duì)照組明顯降低,差異有顯著意義(P＜0.01)。
　　 (6)轉(zhuǎn)染siRNA-548h后G0/G1期細(xì)胞比例增加了17.52%,S期細(xì)胞比例減少了17.13%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

6、　　 (7)轉(zhuǎn)染siRNA-548h后CNE-2Z細(xì)胞未見(jiàn)明顯凋亡(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)針對(duì)eIF4E基因的siRNA可以有效地抑制人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞株中eIF4E基因的表達(dá)。
　　 (2)siRNA干擾eIF4E基因能降低人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的體外增殖能力。
　　 (3)siRNA干擾eIF4E基因能使人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的DNA合成下降(S期細(xì)胞分布比例降低)