siRNA干擾HPV16E6基因?qū)θ吮茄拾〩NE-1細(xì)胞株的影響.pdf

1、目的：以人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株為研究對(duì)象，用針對(duì)HPV16E6的小片段干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，干擾鼻咽癌細(xì)胞株中HPV16E6基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，并探討siRNA對(duì)HNE-1細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的影響作用。 方法：1.轉(zhuǎn)染細(xì)胞：查找HPV16E6基因序列，設(shè)計(jì)針對(duì)E6基因的4對(duì)siRNA。將siRNA轉(zhuǎn)染入HNE-1細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；2.篩選有效的siRaNA。實(shí)驗(yàn)分為5組：4對(duì)siRNA組及陰性

2、對(duì)照組。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HPV16E6 mRNA的表達(dá)，Westernblot及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HPV16E6蛋白表達(dá)情況，篩選出對(duì)HPV16E6干擾有效的siRNA。以有效的siRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞空白組(未轉(zhuǎn)染組)及陰性對(duì)照組(siRNA-5轉(zhuǎn)染組)；3.采用MTT法觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況；4.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期；5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡；6.侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組

3、細(xì)胞的侵襲力變化。 結(jié)果：1.將轉(zhuǎn)染后24h的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，可見綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功，計(jì)算轉(zhuǎn)染率為60％；2.轉(zhuǎn)染后48h，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-3轉(zhuǎn)染組對(duì)HPV16E6mRNA的抑制率為66.3％，與其余4組相比，差異有顯著意義(P＜0.05)：Western blot檢測(cè)發(fā)siRNA-3明顯抑制HV16E6蛋白表達(dá)，抑制率為56.7％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組

4、中HPV16E6陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)為65.2％，而siRNA-3轉(zhuǎn)染組中HPV16E6陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)為20.1％，提示HPV16E6蛋白表達(dá)被抑制；3.MTT結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，細(xì)胞增殖抑制率分別為24％、23％、30％，較陰性對(duì)照組明顯降低，差異有顯著意(P＜0.05)；4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了siRNA-3后G0-G1期比率為80.46％，而陰性對(duì)照組其比率為65.55％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

5、0.05)；5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA-3后HNE-1細(xì)胞凋亡率約為16.82％，與陰性對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；6.侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)(45.3±4.0)明顯少于細(xì)胞空白組穿膜細(xì)胞數(shù)(146.7±5.5)及陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(147.7±4.7)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論：1.針對(duì)HPV16E6的siRNA可以有效地抑制鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株中HPV16E6 mR