生長(zhǎng)激素釋放肽Ghrelin在三磷酸腺苷依賴(lài)蛋白酶介導(dǎo)的自發(fā)糖尿病大鼠心肌保護(hù)效應(yīng)中的作用機(jī)制.pdf

1、現(xiàn)有的研究提示，糖尿病心血管病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制可能有多種因素通過(guò)多種途徑參與。糖尿病引起的內(nèi)皮功能異常、胰島素抵抗、心肌代謝異常是糖尿病心肌重構(gòu)和心肌舒張功能障礙致心功能不全的始動(dòng)環(huán)節(jié)。AMP依賴(lài)蛋白激酶(AMPK)，因可能通過(guò)多種途徑參與保護(hù)心血管效應(yīng)而受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。目前認(rèn)為AMPK是胰島素敏感性的一種正調(diào)節(jié)因子，它不僅參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝，還可通過(guò)調(diào)節(jié)GLUT4和mTOR的表達(dá)影響心肌細(xì)胞的糖代謝以及蛋白質(zhì)合成。

2、 近年來(lái)，Ghrelin的心臟保護(hù)作用逐漸被人們重視，盡管作用機(jī)制仍在探討之中，但其在心血管系統(tǒng)的作用成為目前研究的熱點(diǎn)。Ghrelin在體研究表明，下丘腦內(nèi)注射外源性Ghrelin，可以通過(guò)激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝；細(xì)胞水平的研究表明，Ghrelin可以通過(guò)激活A(yù)MPK改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激?？傊?，越來(lái)越多的科學(xué)研究表明，Ghrelin可能與細(xì)胞代謝的關(guān)鍵酶AMPK有著密切的聯(lián)系。 本研究應(yīng)用外源性的Rat—Ghre

3、lin注射于大鼠腹腔，觀(guān)察其對(duì)大鼠心臟功能、血糖血脂代謝、心臟病理結(jié)構(gòu)的影響，系統(tǒng)評(píng)價(jià)Ghrelin對(duì)自發(fā)性糖尿病大鼠的干預(yù)作用：采用分子生物學(xué)方法，觀(guān)察Ghrelin對(duì)糖尿病大鼠心肌代謝關(guān)鍵酶AMPK以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游所調(diào)控的GLUT4和mTOR表達(dá)的影響，以探討Ghrelin確切的心血管效應(yīng)及其可能的分子機(jī)制，為臨床防治代謝綜合征提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)12周齡雄

4、性GK大鼠(Goto—Kakisaki Wistar rats)24只和SPF級(jí)12周齡雄性Wistar大鼠8只，購(gòu)于上海斯萊科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。分組干預(yù)4周后取血，并采集心肌及胸主動(dòng)脈標(biāo)本。Ghrelin ELISA試劑盒購(gòu)于南京生物技術(shù)公司；Ghrelin多克隆抗體購(gòu)于博士德生物公司；Rat—Ghrelin、P—AMPK多克隆抗體、GLUT4單克隆抗體、mTOR單克隆抗體、β—actin單克隆抗體、RT-PCR試劑盒等購(gòu)于上海S

5、irocco Pharmaceutic公司． 二、實(shí)驗(yàn)方法 大鼠編號(hào)隨機(jī)分為4組：Wistar組：蒸餾水灌胃4周；GK組：同等容量蒸餾水灌胃4周；二甲雙胍組：二甲雙胍350mg/kg/d灌胃4周；Ghrelin組：Rat—Ghrelin200μg/kg/d腹腔注射4周。檢測(cè)各組大鼠血糖、血脂、胰島素、內(nèi)皮素、一氧化氮、腫瘤壞死因子-α、Ghrelin等生化指標(biāo)。12導(dǎo)生理記錄儀測(cè)量左心室收縮壓、左心室舒張末壓、左心室壓力

6、最大上升速率、左心室壓力最大下降速率。采用Masson特染技術(shù)以及免疫組化技術(shù)對(duì)各組大鼠心肌、胸主動(dòng)脈的組織超微結(jié)構(gòu)和病理學(xué)檢查。Western bolt方法檢測(cè)各組大鼠心肌、胸主動(dòng)脈組織mTOR蛋白、AMPK、GLUT4蛋白表達(dá)水平。RT-PCR方法檢測(cè)各組大鼠心肌、胸主動(dòng)脈組織mTOR蛋白、AMPK，GLUT4基因表達(dá)。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，所有的數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS13.0處理。對(duì)于

7、正態(tài)分布的變量采用方差分析進(jìn)行多組間比較，方差不齊者用秩和檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較；非正態(tài)分布的變量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、各組大鼠體重及Lee指數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素處理前，四組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)4周后，Ghrelin組和二甲雙胍組大鼠的體重增長(zhǎng)較GK對(duì)照組減少(P<0.05)；二甲雙胍組大鼠體重增長(zhǎng)最緩慢，接近于正常對(duì)照組。所有自

8、發(fā)性糖尿病大鼠的Lee指數(shù)在實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素處理前，均高于Wistar組大鼠(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)4周后，二甲雙胍組和Ghrelin組大鼠的Lee指數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，均明顯低于GK對(duì)照組(P<0.05)。 二、各組大鼠收縮壓變化 實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素處理前，所有自發(fā)糖尿病大鼠血壓均高于Wistar大鼠(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)4周后，各組大鼠收縮壓水平無(wú)顯著變(P>0.05)化；Ghrelin組和二甲雙胍組收縮壓仍顯著高于

9、Wistar大鼠，較GK組的收縮壓水平略低，但差異不顯著(P>0.05)。 三、各組大鼠糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)的比較 實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素處理4周后，GK組大鼠的HW/BW、FBG、FINS、HOMA—IR、TC、TG、LDL—C、TNF—a明顯高于另外三組(P<0.05)；Ghrelin組的上述指標(biāo)均明顯低于GK組(P<0.05)；二甲雙胍組HW/BW、FBG、FNS、HOMA—IR、TC、TG、TNF—a明顯低于GK組(P<0.0

10、5)，但LDL—C與GK組差異不顯著(P>0.05)。 四、各組大鼠內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)的比較 GK組大鼠血漿ET—1、心肌ET—1、心肌iNOS、血清iNOS高于Wistar組(P<0.05)，心肌NO、血清cNOS、心肌cNOS、血清NO低于Wistar組(P<0.05)；Ghrelin組大鼠血漿ET—1、心肌ET—1、心肌iNOS、血清iNOS較GK組大鼠降低(P<0.05)，心肌NO、血清cNOS、心肌cNOS、血

11、清NO較GK組大鼠升高(P<0.05)。二甲雙胍組血漿ET—1、心肌ET—1、心肌iNOS、心肌NO、血清cNOS、血清iNOS、心肌cNOS較GK組大鼠降低(P<0.05)，心肌iNOS與無(wú)顯著差別(P>0.05)。 五、各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化 實(shí)驗(yàn)4周后，與Wistar組大鼠比較，GK組大鼠的心率、LVEDP升高(P<0.05)；而LVESP、±dp/dtmax降低(P<0.05)；Ghrelin四周干預(yù)后的G

12、K大鼠心率、LVEDP降低，LVESP、±dp/dtmax較Wistar組大鼠顯著升高(P<0.05)；與Wistar組大鼠比較，二甲雙胍組心率、LVEDP降低，±dp/dtmax顯著升高(P<0.05)，但LVESP無(wú)明顯差異(P>0.05)。 六、大鼠心臟HE染色及心肌Masson染色 Wistar組大鼠心肌纖維無(wú)肥大，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，據(jù)于細(xì)胞中心，心肌間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。GK組大鼠心肌細(xì)胞肥大、深染，心肌細(xì)胞邊界

13、不清，細(xì)胞核大小不均勻，心肌Masson染色提示心肌間質(zhì)增生；Ghrelin干預(yù)后，光鏡下心肌細(xì)胞形態(tài)基本完整，無(wú)腫大，Masson染色提示心肌間質(zhì)增生較GK對(duì)照組明顯減輕。二甲雙胍組心肌細(xì)胞形態(tài)基本完整，無(wú)腫大，但Masson染色提示仍有較明顯心肌間質(zhì)增生。 七、各組大鼠血漿Ghrelin水平比較及各組大鼠主動(dòng)脈及心肌免疫組化染色 GK組大鼠血漿及主動(dòng)脈心肌組織免疫組化半定量顯示Ghrelin表達(dá)水平明顯低于Wist

14、ar組(P<0.05)。應(yīng)用Ghrelin干預(yù)組大鼠的血漿Ghrelin水平及免疫組化半定量顯示主動(dòng)脈心肌組織Ghrelin表達(dá)水平高于其它三組(P<0.05)，二甲雙胍組亦高于GK組(P<0.05)。 八、各組大鼠心肌AMPK，GLUT4，mTOR相對(duì)蛋白水平及mRNA表達(dá)量比較 GK組大鼠心肌p—AMPK、GLUT4相對(duì)蛋白表達(dá)水平較Wistar組低(P<0.05)，mTOR相對(duì)蛋白表達(dá)水平較Wistar組高(P<

15、0.05)；Ghrelin及二甲雙胍干預(yù)后大鼠的心肌p—AMPK、GLUT4相對(duì)蛋白表達(dá)水平較Wistar組有所增加(P<0.05)，mTOR相對(duì)蛋白水平較Wistar組有所降低(P<0.05)，尤以Ghrelin組更顯著(P<0.05)。GK組大鼠心肌AMPKα2、GLUT4 mRNA表達(dá)水平較Wistar組低(P<0.05)，mTORmRNA表達(dá)水平較Wistar組高(P<0.05)；Ghrelin及二甲雙胍干預(yù)后大鼠的心肌AMPK

16、α2、GLUT4 mRNA表達(dá)水平較Wistar組有所增加(P<0.05)，mTOR mRNA水平較Wistar組有所降低(P<0-05)，尤以Ghrelin組更顯著(P<0.05)。 結(jié)論： 自發(fā)性糖尿病大鼠存在嚴(yán)重的胰島素抵抗和心肌重構(gòu)以及主動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能改變，生長(zhǎng)激素釋放肽Ghrelin在自發(fā)性糖尿病大鼠血漿及心肌主動(dòng)脈組織中表達(dá)減少。Ghrelin腹腔注射可減輕自發(fā)性糖尿病大鼠胰島素抵抗，改善血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能