組裝抑制蛋白Profilin1促進(jìn)星狀孢菌素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、Profilin1(Pfn1)，又稱(chēng)骨架蛋白結(jié)合蛋白1，是進(jìn)化上高度保守的一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(actin-binding proteins，ABPs)；它可以通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白單體(G-actin)的多聚化和解聚，引起纖維型肌動(dòng)蛋白(F-actin)的動(dòng)態(tài)變化，從而參與調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架的重塑，在細(xì)胞黏附，運(yùn)動(dòng)，生長(zhǎng)等生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的作用。很多文獻(xiàn)證實(shí)當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)，伴隨細(xì)胞遷移侵襲能力的增強(qiáng)同時(shí)出現(xiàn)ABPs表達(dá)的異常改變；而在哺乳

2、動(dòng)物腫瘤細(xì)胞(乳腺癌，肝癌、胰腺癌及鼻咽癌等)中發(fā)現(xiàn)，Pfn1表達(dá)的部分缺失與腫瘤惡性表型密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)外源性Pfn1的乳腺癌細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞形態(tài)和骨架重構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，粘附性增強(qiáng)，更易形成上皮樣結(jié)構(gòu)，且其在異位或原位裸鼠模型中的成瘤作用明顯受到抑制。這些結(jié)果均提示Pfn1可能具有抑癌作用，但其發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制目前并不是很清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作運(yùn)用雙向電泳和質(zhì)譜等技術(shù)探討了誘導(dǎo)分化劑視黃酸對(duì)

3、人肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制，差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)Pfn1為其中一種表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步的研究表明Pfn1參與了全反式視黃酸對(duì)癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制，其抑制作用可能部分通過(guò)上調(diào)Pfn1的蛋白表達(dá)水平來(lái)介導(dǎo)的。因此，我們認(rèn)為Pfn1也許可以成為阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的某些步驟的靶點(diǎn)。由于目前已知的化療藥物和植物提取物治療腫瘤的主要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這提示Pfn1可能對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程產(chǎn)生影響。前期研究發(fā)現(xiàn)天然誘導(dǎo)分化劑星狀孢菌素(St

4、aurosporine，STS)也能夠上調(diào)乳腺腫瘤細(xì)胞中Pfn1的蛋白水平，這提示我們Pfn1在STS誘導(dǎo)的凋亡模型中可能起到關(guān)鍵的作用。STS是一種廣譜的蛋白激酶抑制劑，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系發(fā)生凋亡，因此已被用于進(jìn)行凋亡模型的建立。那么Pfn1在STS誘導(dǎo)的凋亡事件中發(fā)揮什么樣的功能呢?在本研究中我們證實(shí)了Pfn1能夠促進(jìn)STS誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的凋亡，并在此基礎(chǔ)上深入探討了Pfn1促進(jìn)細(xì)胞凋亡及其抑癌作用的分子機(jī)制。
　　

5、已有研究表明在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等組織中Pfn1的表達(dá)低于正常組織。為了探討Pfn1在其它腫瘤組織中的表達(dá)情況，我們選取了大腸癌(包括結(jié)腸癌和直腸癌)腫瘤組織及癌旁組織或遠(yuǎn)端(3cm以上)組織進(jìn)行Pfn1表達(dá)的免疫組織化學(xué)差異性分析，發(fā)現(xiàn)正常組織中Pfn1的表達(dá)比腫瘤組織高，這與在乳腺及肝臟組織中的已有報(bào)道是一致的。同時(shí)，各種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中Pfn1蛋白水平的比較證實(shí)Pfn1在乳腺癌中的表達(dá)是比較低的，且明顯低于正常的乳腺細(xì)胞。我

6、們篩選了幾種乳腺癌細(xì)胞中Pfn1表達(dá)相對(duì)最低的MDA-MB-468這一惡性程度較高的乳腺癌細(xì)胞系為對(duì)象，構(gòu)建了Pfn1過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(Pfn1-468)研究發(fā)現(xiàn)，Pfn1的過(guò)表達(dá)能夠明顯增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)STS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道STS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)理是引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)并引起線粒體的損傷。本文發(fā)現(xiàn)在STS作用下，Pfn1過(guò)表達(dá)能夠顯著降低乳腺癌細(xì)胞的生存率，使處于亞G1期的細(xì)胞明顯增多，并促使核分裂相的出現(xiàn)，

7、DNA的斷裂降解，表明凋亡增強(qiáng)。線粒體膜電位的改變是凋亡早期的主要特征之一，Pfn1過(guò)表達(dá)后促進(jìn)了線粒體膜電位的下降，使得細(xì)胞色素C釋放增多，從而引起內(nèi)源性途徑凋亡酶caspase3、9活性的增加以及級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，從而促進(jìn)了多聚腺苷酸聚合酶(PARP)的剪切。這些研究結(jié)果說(shuō)明Pfn1能夠增強(qiáng)STS引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑即線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。
　　 Caspase的活化需要線粒體釋放細(xì)胞凋亡酶激活因子。Pfn1的過(guò)表達(dá)是否影響細(xì)

8、胞內(nèi)線粒體凋亡激活因子的改變以及其促進(jìn)凋亡的分子機(jī)制目前并沒(méi)有報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)外源性Pfn1的過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-468細(xì)胞內(nèi)凋亡激活因子p53的水平。目前已知近半數(shù)的乳腺癌細(xì)胞中存在的是突變型p53，且突變位點(diǎn)大多位于其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此喪失了轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的細(xì)胞凋亡激活功能。而MDA-MB-468細(xì)胞中含有的正是上述突變型的p53蛋白。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)STS促進(jìn)了突變型p53在細(xì)胞質(zhì)中的定位，并激活其15位絲氨酸的磷

9、酸化，促進(jìn)活化型p53在線粒體的聚集。這些結(jié)果提示突變型p53可能參與了STS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。而Pfn1的過(guò)表達(dá)對(duì)這一過(guò)程起到正調(diào)控的作用。然后，免疫共沉淀及免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)Pfn1能夠與突變型p53相互作用并能促進(jìn)突變型p53在細(xì)胞質(zhì)的定位。以上結(jié)果提示Pfn1通過(guò)調(diào)控p53發(fā)揮轉(zhuǎn)錄非依賴(lài)的促凋亡功能從而增加了細(xì)胞對(duì)STS誘導(dǎo)的凋亡的敏感性，這可能是其發(fā)揮促凋亡功能的機(jī)制之一。
　　 Pfn1作為一個(gè)構(gòu)架蛋白，與肌動(dòng)蛋白及

10、細(xì)胞膜表面蛋白有著密切的聯(lián)系，可通過(guò)與actin相關(guān)的細(xì)胞骨架而參與細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、分裂以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞功能。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，Pfn1在乳腺癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)整合蛋白β1亞基(Integrinβ1)的蛋白水平。已知整合蛋白是一類(lèi)重要的細(xì)胞表面黏附分子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等許多基本生物學(xué)功能；而β1亞基在肝癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)能夠引起S期的阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制。這提示整合蛋白β1可能是Pfn1發(fā)揮促凋亡以及抑癌功

11、能的另一個(gè)靶點(diǎn)。進(jìn)一步的研究顯示Pfn1過(guò)表達(dá)能夠增加β1整合蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性，并能夠促進(jìn)Pfnl-actin-Integrinβ1復(fù)合物的形成。在STS凋亡模型中，β1整合蛋白的下調(diào)或者actin骨架結(jié)構(gòu)的破壞都能夠抑制Pfn1過(guò)表達(dá)所引起的促凋亡功能。這些結(jié)果提示β1亞基參與了Pfn1對(duì)STS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的增敏作用。成熟的整合蛋白分子為異二聚體，β1亞基需要與相應(yīng)的α亞基結(jié)合成為二聚體才能定位在細(xì)胞膜上發(fā)揮其生物學(xué)功能。我們發(fā)

12、現(xiàn)Pfn1過(guò)表達(dá)上調(diào)β1的同時(shí)也上調(diào)了α5亞基的蛋白水平。而受體整合蛋白α5β1的配體纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)能夠逆轉(zhuǎn)Pfn1過(guò)表達(dá)所誘導(dǎo)的促凋亡作用，因此Pfn1過(guò)表達(dá)所引起的整合蛋白受體與其配體間的相對(duì)缺乏可能是其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的另一個(gè)重要的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)了整合蛋白β1亞基過(guò)表達(dá)可抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，而且此細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象與細(xì)胞周期抑制性調(diào)控蛋白p

13、21和p27的表達(dá)密切相關(guān)。為了深入探討整合蛋白β1發(fā)揮抑癌功能的分子機(jī)制，本文首先在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系中驗(yàn)證了整合蛋白β1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)p21是整合蛋白β1亞基過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的細(xì)胞周期S期阻滯和增殖抑制的一個(gè)關(guān)鍵因子；β1亞基過(guò)表達(dá)主要通過(guò)降低c-Jun的水平從而促進(jìn)p21基因的轉(zhuǎn)錄激活。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)整合蛋白β1亞基過(guò)表達(dá)可以在不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)不同類(lèi)型的α亞基表達(dá)，其中α5亞基的增多在β1亞基過(guò)表達(dá)