組裝抑制蛋白Profilin1促進星狀孢菌素誘導的乳腺癌細胞凋亡及其分子機制的研究.pdf

1、Profilin1(Pfn1)，又稱骨架蛋白結(jié)合蛋白1，是進化上高度保守的一種肌動蛋白結(jié)合蛋白(actin-binding proteins，ABPs)；它可以通過調(diào)節(jié)肌動蛋白單體(G-actin)的多聚化和解聚，引起纖維型肌動蛋白(F-actin)的動態(tài)變化，從而參與調(diào)控肌動蛋白骨架的重塑，在細胞黏附，運動，生長等生物學行為中發(fā)揮著重要的作用。很多文獻證實當細胞惡變時，伴隨細胞遷移侵襲能力的增強同時出現(xiàn)ABPs表達的異常改變；而在哺乳

2、動物腫瘤細胞(乳腺癌，肝癌、胰腺癌及鼻咽癌等)中發(fā)現(xiàn)，Pfn1表達的部分缺失與腫瘤惡性表型密切相關，過表達外源性Pfn1的乳腺癌細胞與對照細胞相比，細胞形態(tài)和骨架重構(gòu)發(fā)生改變，細胞生長速度減慢，粘附性增強，更易形成上皮樣結(jié)構(gòu)，且其在異位或原位裸鼠模型中的成瘤作用明顯受到抑制。這些結(jié)果均提示Pfn1可能具有抑癌作用，但其發(fā)揮抑癌作用的分子機制目前并不是很清楚。
　　 本實驗室前期工作運用雙向電泳和質(zhì)譜等技術(shù)探討了誘導分化劑視黃酸對

3、人肝癌細胞的作用機制，差異蛋白質(zhì)表達譜進行比對分析發(fā)現(xiàn)Pfn1為其中一種表達上調(diào)的蛋白質(zhì)，進一步的研究表明Pfn1參與了全反式視黃酸對癌細胞增殖和遷移的抑制，其抑制作用可能部分通過上調(diào)Pfn1的蛋白表達水平來介導的。因此，我們認為Pfn1也許可以成為阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的某些步驟的靶點。由于目前已知的化療藥物和植物提取物治療腫瘤的主要機制是誘導腫瘤細胞凋亡，這提示Pfn1可能對腫瘤細胞凋亡過程產(chǎn)生影響。前期研究發(fā)現(xiàn)天然誘導分化劑星狀孢菌素(St

4、aurosporine，STS)也能夠上調(diào)乳腺腫瘤細胞中Pfn1的蛋白水平，這提示我們Pfn1在STS誘導的凋亡模型中可能起到關鍵的作用。STS是一種廣譜的蛋白激酶抑制劑，能夠誘導多種腫瘤細胞系發(fā)生凋亡，因此已被用于進行凋亡模型的建立。那么Pfn1在STS誘導的凋亡事件中發(fā)揮什么樣的功能呢?在本研究中我們證實了Pfn1能夠促進STS誘導的乳腺癌細胞的凋亡，并在此基礎上深入探討了Pfn1促進細胞凋亡及其抑癌作用的分子機制。
　　

5、已有研究表明在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等組織中Pfn1的表達低于正常組織。為了探討Pfn1在其它腫瘤組織中的表達情況，我們選取了大腸癌(包括結(jié)腸癌和直腸癌)腫瘤組織及癌旁組織或遠端(3cm以上)組織進行Pfn1表達的免疫組織化學差異性分析，發(fā)現(xiàn)正常組織中Pfn1的表達比腫瘤組織高，這與在乳腺及肝臟組織中的已有報道是一致的。同時，各種組織來源的腫瘤細胞中Pfn1蛋白水平的比較證實Pfn1在乳腺癌中的表達是比較低的，且明顯低于正常的乳腺細胞。我

6、們篩選了幾種乳腺癌細胞中Pfn1表達相對最低的MDA-MB-468這一惡性程度較高的乳腺癌細胞系為對象，構(gòu)建了Pfn1過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(Pfn1-468)研究發(fā)現(xiàn)，Pfn1的過表達能夠明顯增強乳腺癌細胞對STS誘導的細胞凋亡的敏感性。根據(jù)文獻報道STS誘導細胞凋亡的主要機理是引發(fā)氧化應激反應并引起線粒體的損傷。本文發(fā)現(xiàn)在STS作用下，Pfn1過表達能夠顯著降低乳腺癌細胞的生存率，使處于亞G1期的細胞明顯增多，并促使核分裂相的出現(xiàn)，

7、DNA的斷裂降解，表明凋亡增強。線粒體膜電位的改變是凋亡早期的主要特征之一，Pfn1過表達后促進了線粒體膜電位的下降，使得細胞色素C釋放增多，從而引起內(nèi)源性途徑凋亡酶caspase3、9活性的增加以及級聯(lián)反應的發(fā)生，從而促進了多聚腺苷酸聚合酶(PARP)的剪切。這些研究結(jié)果說明Pfn1能夠增強STS引發(fā)的細胞內(nèi)凋亡途徑即線粒體途徑的細胞凋亡。
　　 Caspase的活化需要線粒體釋放細胞凋亡酶激活因子。Pfn1的過表達是否影響細

8、胞內(nèi)線粒體凋亡激活因子的改變以及其促進凋亡的分子機制目前并沒有報道。我們發(fā)現(xiàn)外源性Pfn1的過表達能夠上調(diào)乳腺癌細胞株MDA-MB-468細胞內(nèi)凋亡激活因子p53的水平。目前已知近半數(shù)的乳腺癌細胞中存在的是突變型p53，且突變位點大多位于其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此喪失了轉(zhuǎn)錄依賴的細胞凋亡激活功能。而MDA-MB-468細胞中含有的正是上述突變型的p53蛋白。進一步的研究發(fā)現(xiàn)STS促進了突變型p53在細胞質(zhì)中的定位，并激活其15位絲氨酸的磷

9、酸化，促進活化型p53在線粒體的聚集。這些結(jié)果提示突變型p53可能參與了STS誘導的細胞凋亡過程。而Pfn1的過表達對這一過程起到正調(diào)控的作用。然后，免疫共沉淀及免疫熒光實驗證實Pfn1能夠與突變型p53相互作用并能促進突變型p53在細胞質(zhì)的定位。以上結(jié)果提示Pfn1通過調(diào)控p53發(fā)揮轉(zhuǎn)錄非依賴的促凋亡功能從而增加了細胞對STS誘導的凋亡的敏感性，這可能是其發(fā)揮促凋亡功能的機制之一。
　　 Pfn1作為一個構(gòu)架蛋白，與肌動蛋白及

10、細胞膜表面蛋白有著密切的聯(lián)系，可通過與actin相關的細胞骨架而參與細胞黏附、生長、分裂以及信號轉(zhuǎn)導等多種細胞功能。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，Pfn1在乳腺癌細胞中的過表達能夠上調(diào)整合蛋白β1亞基(Integrinβ1)的蛋白水平。已知整合蛋白是一類重要的細胞表面黏附分子，可以調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等許多基本生物學功能；而β1亞基在肝癌細胞中的過表達能夠引起S期的阻滯，導致細胞增殖的抑制。這提示整合蛋白β1可能是Pfn1發(fā)揮促凋亡以及抑癌功

11、能的另一個靶點。進一步的研究顯示Pfn1過表達能夠增加β1整合蛋白在細胞中的穩(wěn)定性，并能夠促進Pfnl-actin-Integrinβ1復合物的形成。在STS凋亡模型中，β1整合蛋白的下調(diào)或者actin骨架結(jié)構(gòu)的破壞都能夠抑制Pfn1過表達所引起的促凋亡功能。這些結(jié)果提示β1亞基參與了Pfn1對STS誘導的細胞凋亡的增敏作用。成熟的整合蛋白分子為異二聚體，β1亞基需要與相應的α亞基結(jié)合成為二聚體才能定位在細胞膜上發(fā)揮其生物學功能。我們發(fā)

12、現(xiàn)Pfn1過表達上調(diào)β1的同時也上調(diào)了α5亞基的蛋白水平。而受體整合蛋白α5β1的配體纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)能夠逆轉(zhuǎn)Pfn1過表達所誘導的促凋亡作用，因此Pfn1過表達所引起的整合蛋白受體與其配體間的相對缺乏可能是其促進細胞凋亡的另一個重要的機制。
　　 實驗室前期研究證實了整合蛋白β1亞基過表達可抑制人肝癌細胞株SMMC-7721的細胞增殖，并誘導細胞周期阻滯，而且此細胞周期阻滯現(xiàn)象與細胞周期抑制性調(diào)控蛋白p

13、21和p27的表達密切相關。為了深入探討整合蛋白β1發(fā)揮抑癌功能的分子機制，本文首先在多種組織來源的腫瘤細胞系中驗證了整合蛋白β1過表達對細胞增殖的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)p21是整合蛋白β1亞基過表達所導致的細胞周期S期阻滯和增殖抑制的一個關鍵因子；β1亞基過表達主要通過降低c-Jun的水平從而促進p21基因的轉(zhuǎn)錄激活。同時我們發(fā)現(xiàn)整合蛋白β1亞基過表達可以在不同組織來源的腫瘤細胞中誘導不同類型的α亞基表達，其中α5亞基的增多在β1亞基過表達